李紅英，陳菲菲，殷紅清，覃大吉，孫舉志，楊永康，向極釬，李亞杰

（1.恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學院，湖北 恩施 445000；2.湖北省富硒產(chǎn)業(yè)技術研究院，湖北 恩施 445000）

白術（Atractylodes macrocephalaKoidz.）是一種名貴中藥材，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎等功效［1-7］。近年來，白術藥材應用廣泛，市場需求大，但白術品種嚴重退化，生產(chǎn)周期長，土壤不能連續(xù)利用，只能輪作，給栽培帶來許多困擾。導致白術藥材產(chǎn)量與質量嚴重下降，無法滿足市場需求。鑒于此，本試驗采用無菌優(yōu)良白術種苗（生產(chǎn)上表現(xiàn)好的一類型Ⅱ［8］）為外植體，開展組培快繁技術與提純復壯研究工作，得到一種優(yōu)良、穩(wěn)定、健壯的新品種，促進了白術次生代謝產(chǎn)物的研究與開發(fā)［9，10］，進一步縮短了生產(chǎn)周期，擴大繁殖系數(shù)，改善白術藥材的生產(chǎn)現(xiàn)狀，為白術新品種選育技術奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以無菌培養(yǎng)體系中白術優(yōu)勢種群、優(yōu)良單株、健壯、幼嫩的白術苗為外植體，根據(jù)外植體的大小和腋芽的多少將其修剪成1.0～2.5 cm長的一葉一芽的小腋芽，每株可修剪成3～5個小腋芽，置于培養(yǎng)皿中。

1.2 方法

1.2.1 叢生芽分化誘導液體培養(yǎng)基的篩選 使用經(jīng)過高壓滅菌的醫(yī)用鑷子、醫(yī)用剪刀，將處理好的小腋芽按每瓶一個直接接種到裝有叢生芽分化誘導液體培養(yǎng)基支撐墊（腋芽托，其中所用培養(yǎng)瓶為圓柱形的300 mL玻璃瓶，每瓶裝60～80 mL液體培養(yǎng)基，液面上加一個支撐墊，接種時支撐墊的一半浸在叢生芽分化誘導液體培養(yǎng)基中。下同）上：1/2 MS、1.0～2.0 mg/L 6-BA、0.4～0.8 mg/L NAA、0.1～0.5 mg/L IBA、0.2～0.6 mg/L GA3、35～50 g/L蔗糖，pH 5.8～6.0，并于光照時間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，溫度（24±2）℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)10～15 d，應用L（934）正交試驗統(tǒng)計結果。

1.2.2 對分化誘導形成的叢生芽進行生長培養(yǎng) 在超凈工作臺上，將分化誘導形成的叢生芽培養(yǎng)到1～2 cm后，將原有培養(yǎng)基吸出，灌入生長液體培養(yǎng)基：MS+20～40 g/L蔗糖，每瓶裝80～100 mL，支撐墊的一半浸在液體生長培養(yǎng)基中。培養(yǎng)11～15 d即可長滿瓶。

1.2.3 對生長培養(yǎng)的叢生芽進行生根誘導液體培養(yǎng)基篩選 在超凈工作臺上，將培養(yǎng)的叢生芽修剪成1～2 cm長的小腋芽，按每瓶1～5芽轉接到生根誘導液體培養(yǎng)基中：1/4 MS、0.1～0.7 mg/L NAA、0.2～0.5 mg/L IBA，蔗糖30～50 g/L，pH 5.8～6.0。于光照時間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，溫度（24±2）℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7～12 d后，以30株為一組，每組3次重復，統(tǒng)計試驗結果。

1.2.4 對生根誘導培養(yǎng)的叢生芽進行壯苗培養(yǎng) 在超凈工作臺上，待新根長出0.5～1.5 cm時，將叢生芽誘導生根液體培養(yǎng)基吸出，再灌入壯苗液體培養(yǎng)基：MS+20～40 g/L蔗糖，pH 5.8。并于光照時間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，溫度（24±2）℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7～10 d。

1.3 煉苗移栽

對通過壯苗培養(yǎng)的叢生芽進行煉苗處理（敞瓶煉苗、基質煉苗）；將生根壯苗培養(yǎng)基置于煉苗室常溫閉瓶煉苗0～3 d，旋松生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶蓋0～2 d，全開瓶蓋1～3 d；敞瓶煉苗完成后將白術苗置于清水中，洗去根部培養(yǎng)液，撈出，移栽至裝有泥炭土∶珍珠巖按2∶1比例配成的混合物穴盤基質中，每2 d噴水1次，3 d后噴施1 g/L的多菌靈或甲基托布津，隔5 d再噴施1次以防病菌。15 d后逐漸減少噴水的次數(shù)，并定期噴施一次組分為1/8 MS的營養(yǎng)液，生長20～30 d，待有新生根系將基質包裹，形成穩(wěn)定的根系基質系統(tǒng)，即可定植于富含腐殖質的沙質土壤中。以300株為一組，分為5組，培養(yǎng)20 d后分別統(tǒng)計成活率。成活率為95%以上。

1.4 苗圃移栽和管理

生產(chǎn)白術栽子（白術種苗）：將4—6月移栽至苗圃的白術叢生芽苗，返青期間（移栽30～40 d）進行適當遮陽，10 d澆水一次，15 d噴施一次1 g/L多菌靈以防病菌，返青期后，去掉遮陽設備，在白術叢生芽苗的行間施一定量的農(nóng)家肥，進行人工除草，按照白術種苗生產(chǎn)技術規(guī)程（DB42/T 328—2005）的要求進行栽培管理。10月下旬到11月上旬起挖根莖，勿傷主芽和根狀莖表皮，置室內(nèi)通風處攤放5～10 d，待外皮發(fā)白時，貯藏待種。以50株為一組，分別以5組試驗為對比，分析白術組培苗與種子苗的產(chǎn)量。

1.5 白術栽子進行分級和包裝

將所得典型白術優(yōu)勢種群的種苗，依據(jù)白術種苗等級標準，按根莖重、根數(shù)、根莖直徑和感觀指標分為一、二、三等。進行分級和包裝。

2 結果與分析

2.1 白術腋芽分化誘導液體培養(yǎng)正交試驗結果

正交試驗因素和水平及結果見表1和表2，腋芽分化誘導培養(yǎng)4～10 d后，觀察到腋芽開始生長分化；經(jīng)分化誘導25 d后，平均每瓶可長出3.0～5.5個叢生芽，每個叢生芽可修剪成3～5個小腋芽，增殖倍數(shù)為9.0～27.5。由R1的大小可知，影響白術叢生芽增殖率依次為B＞D＞C＞A，由R2的大小可知，影響白術叢生芽增值倍數(shù)依次為D＞B＞C＞A；9組試驗中只有第四組試驗所得白術叢生芽增殖率與增殖倍數(shù)最佳。因此，得到最優(yōu)白術腋芽分化誘導液體培養(yǎng)基的植物生長素為A2B1C2D3，即1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.3 mg/L IBA+0.6 mg/L GA3為白術腋芽分化誘導較為理想的培養(yǎng)基。此條件下白術腋芽叢生芽增殖率高達97.3%，增殖倍數(shù)為16。

表1 正交試驗因素和水平 （單位：mg/L）

表2 正交試驗結果及分析

2.2 叢生芽生根誘導液體培養(yǎng)基篩選結果

結果見表3，將培養(yǎng)到2 cm左右的白術叢生芽剪切后轉到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4～6 d后，觀察到新根長出。4～10 d后觀察到根和芽開始生長，培養(yǎng)20 d后，平均生根數(shù)為6～8根/芽，生長素NAA和IBA共同作用能促進白術試管苗快速生根，但是生長素濃度大小差異明顯，生根效果以1/4 MS+0.2 mg/L IBA+0.4 mg/L NAA最佳，濃度過高時根容易形成餅狀畸形，濃度過低生根時間較長，生根率較低。

表3 植物生長素誘導叢生芽生根效果，以1/4 MS為基礎

2.3 移栽試驗結果

試管苗移栽較適空氣濕度保持在75%～85%，遮光率40%，環(huán)境溫度控制在20～26℃，定期噴施營養(yǎng)液，并加強移栽后管理，定時噴施殺菌劑，做好防霉防病工作。4—6月常溫下均可移栽，20 d后，統(tǒng)計成活率為94%以上。

2.4 白術栽子苗與種子栽子苗的比較

通過對組培苗規(guī)范性管理，所得的白術無性種苗大小均勻，皆是典型白術優(yōu)勢種群Ⅱ的種苗類型，無畸形，組培苗一年生種苗平均單株重是咸豐白術種子種苗的3.37倍，明顯優(yōu)于種子種苗（表4）。

表4 白術種子種苗與組培苗產(chǎn)量比較（單位：g）

2.5 對苗圃生產(chǎn)的白術栽子進行分級和包裝

按照白術種苗等級標準，將白術栽子劃分為一、二、三等，其中一等為80%，二等為15%，三等為5%?？梢娊M培苗生產(chǎn)出的白術栽子80%以上為上等，大大提高了種苗的質量與產(chǎn)量。增加了育苗的新途徑，加大了種苗的育種進程。

3 小結

白術類型Ⅱ作為優(yōu)良單株繁殖的無菌體系，不僅在試管苗階段既能保持較好的遺傳品質和母體遺傳的穩(wěn)定性，又能將優(yōu)良品種應用到實際生產(chǎn)中，因此，白術類型Ⅱ可選為無菌體系外植體。

6-BA、NAA、IBA、GA34種植物生長調(diào)節(jié)素相互作用共同促進白術腋芽誘導分化的形成培養(yǎng)，加上運用植物液體培養(yǎng)條件，大大提高了白術的繁殖系數(shù)和縮短了白術擴繁的生長周期，每個周期可以擴大上萬倍的試管苗，如果外界條件允許，比如建有保溫大棚等，每個季節(jié)都可以移栽試管苗，再不受季節(jié)的影響，隨時都有白術苗出售，這為育種和生產(chǎn)過程中保存和利用優(yōu)質中間體材料提供了科學的依據(jù)，克服了種子繁殖后代性狀嚴重分離的現(xiàn)象，也縮短了白術品種選育年限。

生長素IBA、NAA共同促進白術試管苗根的生長，大約轉接4 d后生根，根系生長發(fā)達旺盛，大約21 d便可以移栽，不受季節(jié)的影響，而原來單獨利用NAA生長素促進白術根的生長，受到植株季節(jié)的影響，春季生長快速，但是夏、秋、冬三個季節(jié)生長卻很緩慢，甚至停止生長。這個突破點，為白術藥材品質的篩選奠定了一定的基礎。