管凇 周漢林 徐鐵山 孫衛(wèi)平 胡海超

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 海南海口 571101)

海南黑山羊是海南唯一的地方優(yōu)良山羊品種，在海南各市、縣均有分布，但是，生長(zhǎng)緩慢，繁殖力低，個(gè)體小，產(chǎn)肉性能低，出欄率低，市場(chǎng)供不應(yīng)求，缺口大，嚴(yán)重影響海南黑山羊的產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；l(fā)展。海南黑山羊經(jīng)濟(jì)性狀多受遺傳因素的影響。目前，針對(duì)海南養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，擴(kuò)大群體數(shù)量，保護(hù)黑山羊優(yōu)良的遺傳基因的同時(shí)，培育出高產(chǎn)又具海南特色的黑山羊新品種，進(jìn)一步提高品種生產(chǎn)性能、產(chǎn)肉性能和繁殖性能，推動(dòng)海南養(yǎng)羊業(yè)規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展勢(shì)在必行。因此，通過分子手段對(duì)海南黑山羊生長(zhǎng)性狀的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行解析，可以為海南黑山羊的分子育種提供一定的參考依據(jù)。

根據(jù)研究表明，生長(zhǎng)激素1基因（GH1）可能是導(dǎo)致個(gè)體矮小的基因，為2.54 kb，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成［1］，是控制哺乳動(dòng)物的新陳代謝和生長(zhǎng)性狀的基因。山羊GH1基因的遺傳多態(tài)性已經(jīng)報(bào)道［1-2］，其他牲畜物種也有研究［3-6］。在埃及和沙特山羊［1］和中國波爾山羊［2］群體中發(fā)現(xiàn)GH1多態(tài)現(xiàn)象與生長(zhǎng)性狀有關(guān)。Wickramaratne等［7］提出，GH1基因可用于生長(zhǎng)性能的標(biāo)記輔助選擇。在南非山羊品種內(nèi)和品種間存在GH1的遺傳多樣性，在外顯子2和5處觀察到導(dǎo)致氨基酸變化的突變［8］。

本研究對(duì)海南黑山羊GH1基因編碼區(qū)進(jìn)行SNPs篩選，并與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，旨在篩選可能影響海南黑山羊生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記突變位點(diǎn)，也為應(yīng)用標(biāo)記輔助選擇改良山羊生長(zhǎng)等重要經(jīng)濟(jì)性狀提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

海南黑山羊來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所山羊保種場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和DNA處理

對(duì)104只成年山羊的體長(zhǎng)、體高、體重進(jìn)行測(cè)量。剪取耳組織，置于裝有75%乙醇的離心管中，4℃保存。采用DNA提取試劑盒提取耳組織總DNA，用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)每個(gè)樣品DNA質(zhì)量濃度。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢山羊GH1基因DNA序列（GenBank登錄號(hào)：NC_030826），根據(jù)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的序列信息，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Plex 2設(shè)計(jì)引物，使用primer3plus在線設(shè)計(jì)單堿基延伸引物，引物信息見表1。

表1 引物信息

1.2.3 SNP位點(diǎn)的篩選和分型

對(duì)提取的DNA基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為 10 μL：5 μL 5×TaqPCRmastermix，上下游引物各0.5 μL（20 μmol/L），模板DNA 1 μL（20ng/μL），加ddH2O至10μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；40個(gè)循環(huán) （94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃30 min）；72℃再延伸3 min。將PCR產(chǎn)物去除體系中游離的dNTPs，再進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積5 μL。PCR產(chǎn)物委托武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司采用SnaPshot方法，用Gene marker分析得到的.fsa結(jié)果，導(dǎo)出峰圖及表格文件，并統(tǒng)計(jì)出每個(gè)樣品的SNP位點(diǎn)的基因型。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用Popgene 32（version 3.2）軟件和PICCALC程序?qū)NPs位點(diǎn)的分型結(jié)果進(jìn)行處理，計(jì)算遺傳參數(shù)信息。采用SPSS 2.0軟件X2檢驗(yàn)對(duì)群體中各SNPs位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，從而與生長(zhǎng)性狀（體長(zhǎng)、體高、體重）性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNPs位點(diǎn)在群體中的遺傳參數(shù)分析

10個(gè)SNPs位點(diǎn)中有4個(gè)錯(cuò)義突變，6個(gè)為同義突變，錯(cuò)義突變位點(diǎn)分別是Exon1-350G→A（G31S）、Exon2-739G→A（G85S），Exon3-1101A→G（D129G）、Exon3-1154C→T（R147W）。多態(tài)信息含量（PIC）是衡量基因變異程度的指標(biāo)，當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，屬于高度變異多態(tài)；當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時(shí)，屬于中度變異多態(tài)；當(dāng)PIC＜0.25是屬于低度多態(tài)變異。10個(gè)SNPs位點(diǎn)在海南黑山羊群體中所統(tǒng)計(jì)分析得出的遺傳參數(shù)值見表2，有9個(gè)SNPs位點(diǎn)都屬于中度多態(tài)位點(diǎn)，一個(gè)位點(diǎn)處于低度多態(tài)，9個(gè)位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（p＞0.05），一個(gè)位點(diǎn)沒有檢測(cè)到P值，見表2。

表2 GH1基因上的10個(gè)SNPs位點(diǎn)的遺傳參數(shù)分析

2.2 不同SNP位點(diǎn)與性狀關(guān)聯(lián)分析

利用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)各基因的不同SNP對(duì)應(yīng)的表型（體長(zhǎng)、體高和體重）的平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差，詳細(xì)結(jié)果見表3。利用SPSS中的一般線性模型對(duì)各基因的SNPs位點(diǎn)與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，GH1基因外顯子1、2、3、4檢測(cè)到10個(gè)SNPs位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)均只有2種基因型。一般線性模型的主體間效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果顯示，所有SNP位點(diǎn)基因型與表型（體長(zhǎng)，體高和體重）均未有顯著差異。

表3 突變位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

動(dòng)物的生長(zhǎng)性狀是一種復(fù)雜的數(shù)量性狀，個(gè)體大小由遺傳、環(huán)境、飼養(yǎng)條件等因素相互作用而決定。對(duì)這些復(fù)雜的數(shù)量性狀來說，單基因的突變、關(guān)聯(lián)基因上的SNP變化是引起個(gè)體大小差別的遺傳基礎(chǔ)［9］。SNP是畜禽DNA序列中最常見的一種突變形式，其對(duì)性狀的功能和作用機(jī)制解析是當(dāng)前基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。GH1基因?qū)儆诎』?。GH1基因是IGHD（特發(fā)性生長(zhǎng)激素缺乏癥）中研究最深入的基因［10］。GH1基因突變患者表現(xiàn)為GH缺乏或減少，GH功能嚴(yán)重喪失，表現(xiàn)身材矮小、生長(zhǎng)遲緩、骨骼成熟延遲［11］。Curi等［12］研究結(jié)果顯示，GH1基因多態(tài)性的ll基因型與牛屠宰時(shí)的增重和體重顯著相關(guān)。Cheng等［13］研究揭示，GH1基因的多態(tài)性與豬體重明顯相關(guān)。Pal等［14］研究表明，GH1基因的突變影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致雜交牛的生長(zhǎng)，繁殖和產(chǎn)奶量減少。本研究對(duì)檢測(cè)到的海南黑山羊GH1基因的10個(gè)SNPs位點(diǎn)，其基因型與生長(zhǎng)性狀（體長(zhǎng)、體高、體重）關(guān)聯(lián)性分析顯示，差異并不顯著，可能與檢測(cè)樣本數(shù)量和群體分布有一定關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)采集的樣本來自本所種羊的一個(gè)保種場(chǎng)，長(zhǎng)期圈養(yǎng)、近交等因素導(dǎo)致群體性狀趨于一致。