潘麗梅 黃芩芬 陳乾平 萬凌云 付金娥 韋樹根

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 廣西南寧 530023)

馬兜鈴科馬兜鈴屬植物通城虎（Aristolochia fordiana Hemsl.），別名五虎通城、定心草、萬丈藤、大散血、血蒟等，生于灌叢或石隙，分布于浙江、江西等地，廣西是其主產(chǎn)區(qū)之一［1］。通城虎味苦、辛，性溫，有小毒，有解毒消腫、祛風(fēng)鎮(zhèn)痛、行氣止咳之效，主治風(fēng)濕骨痛、胃脘痛、腹痛、咽喉炎、跌打損傷、小兒驚風(fēng)、毒蛇咬傷［2-3］。野生的通城虎資源通常分布于丘陵林下灌木叢中或者周邊石隙中，對生長環(huán)境有一定的要求，因此導(dǎo)致分布范圍并不廣泛。目前國內(nèi)外對通城虎研究極少，尤其對其繁殖方面的研究少之又少，且多限于化學(xué)成分及藥理毒性相關(guān)研究［3-5］。近年來隨著通城虎資源的不斷減少及市場需求量的不斷增加，對野生資源的采集量逐漸增大，導(dǎo)致野生通城虎資源的破壞甚至瀕臨枯竭。通過組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，可以有效地利用通城虎的種質(zhì)資源并快速增加其繁殖系數(shù)，不僅能滿足中藥市場對通城虎藥材的需求，更有利于通城虎資源的保護(hù)。因此，本研究以通城虎植株幼嫩莖段為外植體，探討不同消毒時間及含不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基對通城虎莖段污染、褐化及出芽、生根的影響，以期為通城虎的組織培養(yǎng)快繁提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

試驗材料采自廣西藥用植物園科研基地種質(zhì)資源圃，采集通城虎帶有嫩葉的幼嫩莖段，去除多余的老葉后用自來水流水沖洗干凈備用。

1.1.2 試劑

主要試劑包括MS培養(yǎng)基、1/2 MS培養(yǎng)基、升汞、75%酒精、2%次氯酸鈉；生長素類似物α-萘乙酸（NAA）、引哚丁酸（IBA）以及2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）；細(xì)胞分裂素6-芐氨基嘌呤（6-BA）、激動素（KT）。

1.2 方法

1.2.1 滅菌方式及滅菌時間的確定

將所采集的枝條剪成1.0～2.0 cm長的帶芽莖段，去掉多余葉片，保留葉柄基部；在加有1%洗潔精的洗滌液中浸泡10～15 min，再用慢流水沖洗15 min；使用4種不同的滅菌方式對外植體進(jìn)行滅菌處理，分別如下：用75%酒精浸泡（處理1）；用0.1%升汞溶液浸泡（處理2）；先用75%酒精浸泡10～30 s再用0.1%升汞溶液浸泡（處理3）；用2%次氯酸鈉溶液浸泡（處理4）。浸泡時間均分別設(shè)置為4、6、8、10 min，最后用無菌水沖洗4～5次，取出后用滅菌后的紗布吸干表面水分，切去莖段兩頭部位，接種在常規(guī)的MS培養(yǎng)基中；接種15 d后，統(tǒng)計污染率和成活率，篩選出合適的消毒劑及消毒時間。

1.2.2 初代誘導(dǎo)

按完全隨機(jī)試驗設(shè)計，將經(jīng)過預(yù)處理后的外植體莖段接種到含有不同類型和配比的植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基中，每個處理接種20瓶，每瓶接種1個莖段，重復(fù)3次，隨時觀察記錄莖段的萌芽率、芽生長狀況等。

1.2.3 增殖培養(yǎng)

選取初代誘導(dǎo)中萌發(fā)后生長狀況一致的組培苗，切取1 cm左右的芽苗接種到含有不同類型及不同濃度激素（6-BA、NAA、IBA）的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每個處理接種5瓶，每瓶接種3個芽苗；隨后觀察記錄芽苗的增殖及生長情況，篩選出最適合通城虎組培苗增殖培養(yǎng)的激素組合。

1.2.4 生根培養(yǎng)

經(jīng)增殖培養(yǎng)后，選取生長健壯、高約2 cm的增殖苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基采用1/2 MS培養(yǎng)基附加不同濃度的IBA（0.2、0.5、1.0、1.5 mg/L） 和 NAA （0.2、0.5、1.0 mg/L），每個處理接種5瓶，每瓶接種3個增殖苗；觀察記錄生根情況及整株生長狀況。

1.2.5 煉苗基質(zhì)篩選

將完成生根的組培苗移出培養(yǎng)室，開蓋煉苗后進(jìn)行移栽，研究不同基質(zhì)處理對組培苗移栽成活率的影響，以期對通城虎種苗的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論參考。不同基質(zhì)處理如下：（1）輕基質(zhì)；（2）輕基質(zhì)∶河沙∶珍珠巖＝5∶3∶1（V∶V∶V，下同）；（3）塘泥；（4）塘泥∶河沙∶珍珠巖＝5∶3∶1；（5）育苗土；（6）育苗土∶河沙∶珍珠巖＝5∶3∶1。移栽后搭設(shè)遮陽網(wǎng)，觀察記錄移栽苗成活率及生長狀況，篩選適合通城虎組培苗移栽的最佳基質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌方式及滅菌時間的確定

由表1可以看出，不同的滅菌方式及滅菌時間處理對通城虎外植體的滅菌效果影響差異明顯，僅用75%酒精浸泡的處理污染最嚴(yán)重，成活率也最低，不適合通城虎外植體的滅菌處理，滅菌時間過短也達(dá)不到滅菌效果；75%酒精和升汞的組合處理效果較好，隨著處理時間的延長，滅菌效果越長，但時間過長也會影響成活率。綜合考慮污染率和成活率，處理3滅菌效果較好，即先用75%酒精浸泡10～30 s，再用0.1%升汞溶液浸泡8 min；其次是處理2和處理4。

表1 不同滅菌方式及滅菌時間對通城虎組織培養(yǎng)污染率和成活率的影響 單位：%

2.2 不同激素處理對通城虎初代誘導(dǎo)的影響

由表2可知，不同激素處理對通城虎莖段的初代誘導(dǎo)有不同的影響。單獨使用6-BA誘導(dǎo)效果較差；而6-BA與KT組合使用則誘導(dǎo)效果較好，其中，6-BA濃度達(dá)到1.0 mg/L時，添加不同濃度的KT和2，4-D誘導(dǎo)效果最好，當(dāng)6-BA濃度超過1.5 mg/L時，誘導(dǎo)效果反而下降。2，4-D在誘導(dǎo)愈傷組織方面的作用更為明顯，因此綜合芽誘導(dǎo)的啟動時間及誘導(dǎo)率可知，處理5（6-BA 1.0 mg/L＋KT 1.0 mg/L＋2，4-D 0.5 mg/L）誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)100%。

表2 不同激素處理對通城虎初代誘導(dǎo)的影響

2.3 不同激素處理對通城虎增殖培養(yǎng)的影響

不同激素處理對通城虎叢生芽增殖分化的影響不同，激素濃度的高低直接影響其增殖系數(shù)和芽長勢。由表3可以看出，將通城虎接種于不含任何激素的空白培養(yǎng)基中，無增殖效果。在相同6-BA濃度下，添加少量IBA可明顯提高芽的增殖系數(shù)，但NAA的使用對增殖的影響不大。同時，隨著6-BA濃度的增加，雖然也有一定的增殖效果，但也極易出現(xiàn)絮狀愈傷組織，影響成苗。因此最佳的激素濃度組合為6-BA 1.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L，即處理6，其增殖系數(shù)最高，為（5.53±1.68），且芽生長健壯，葉綠，適合下一步的生根煉苗。

表3 不同激素處理對通城虎增殖培養(yǎng)的影響

2.4 不同激素組合對通城虎生根培養(yǎng)的影響

不同的激素處理都能誘導(dǎo)組培苗生根，但不同的激素濃度生根效果有較大差異。由表4可以看出，MS培養(yǎng)基不適合生根，生根率低且生長弱，比較適合生根的是1/2 MS培養(yǎng)基；隨著激素使用濃度的加大，生根效果越好，但是當(dāng)IBA和NAA濃度都在1.0 mg/L時，雖然生根效果不錯，但根部易出現(xiàn)絮狀愈傷組織，影響移栽成活率。因此，最適合通城虎生根的是處理5（6-BA 1.0 mg/L＋KT 1.0 mg/L＋2，4-D 0.5 mg/L），生根率達(dá)到96.33%。

表4 不同激素組合對通城虎生根培養(yǎng)的影響

2.5 不同基質(zhì)對通城虎組培苗移栽效果的影響

適合的移栽基質(zhì)不僅能提高組培苗移栽成活率，也能提高幼苗生長質(zhì)量。由表5可以看出，處理1的輕基質(zhì)最適合通城虎組培苗的移栽，成活率達(dá)到96%以上，且生長狀態(tài)良好。輕基質(zhì)的成分主要為泥炭土、珍珠巖和蛭石，無需混合其他基質(zhì)即能滿足組培苗的移栽種植；單獨的育苗土或者塘泥不適合通城虎組培苗的移栽。

表5 不同基質(zhì)對通城虎組培苗移栽效果的影響

3 討論與結(jié)論

組織培養(yǎng)前必須進(jìn)行莖段滅菌處理，不同的物種類型（如木本、草木）以及莖段的幼嫩程度等都對滅菌方式及滅菌時間有不同的要求。同科屬其他植物的組織培養(yǎng)中，馬兜鈴用12.5 mol/L的乙醇消毒30 s，然后再用0.05%的升汞消毒10～18 min才達(dá)到滅菌效果［6］；而貫葉馬兜鈴的幼嫩莖段則是先用5%酒精浸泡30～40 s，再用0.1%升汞溶液浸泡3 min，方可達(dá)到滅菌效果［7］。本試驗中，通城虎幼嫩莖段經(jīng)75%酒精浸泡10～30 s，再用0.1%升汞溶液浸泡8 min，滅菌效果較佳。除了滅菌劑的使用濃度不同外，試驗中所采集莖段的幼嫩程度也可能不一樣，越幼嫩的莖段，滅菌劑處理時間應(yīng)越短。

不同的植物生長物質(zhì)是植物組織培養(yǎng)中不可或缺的因子，6-BA和KT都是植物組織培養(yǎng)中常用的細(xì)胞分裂素。在本研究中，單獨使用6-BA的誘導(dǎo)效果較差，與黃果西番蓮［8］、南瓜［9］、白木通［10］等的研究結(jié)果相似，當(dāng)在添加6-BA基礎(chǔ)上添加不同濃度的KT和2，4-D可達(dá)到較好的誘導(dǎo)效果，但2，4-D不宜過高，否則容易長愈傷組織，從而影響出芽。增殖培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，是培養(yǎng)健壯生根苗的基礎(chǔ)。本研究中，6-BA 1.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L的組合增殖系數(shù)最高，達(dá)到5.53，但NAA對通城虎的增殖培養(yǎng)沒有明顯作用。6-BA作為增殖培養(yǎng)的主導(dǎo)因子，其濃度對增殖培養(yǎng)有明顯的促進(jìn)作用，但濃度過高也容易誘發(fā)愈傷組織，因此適合的6-BA濃度至關(guān)重要，這與白木通［10］、海棠［11］等的研究結(jié)果一致。

組培苗的生根及移栽是植物組織培養(yǎng)體系最后的也是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，生長素IBA與NAA組合更有利于生根，但需要適合的濃度。本研究中，當(dāng)IBA和NAA的使用濃度超過1.0 mg/L時，容易出現(xiàn)愈傷組織，不利于根系形成及后續(xù)移栽。同時本研究也發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基不適合生根，可能是營養(yǎng)過剩，促進(jìn)了營養(yǎng)生長，但影響了根系生長，與香鱗毛蕨［12］等的研究結(jié)果一致。在組織培養(yǎng)中，基質(zhì)類型和配比是組培苗成活與否的重要因素。本研究中，輕基質(zhì)即能滿足移栽需求，輕基質(zhì)的成分主要為一定比例的泥炭土、珍珠巖和蛭石，若另外再加入河沙和珍珠巖，移栽效果反而下降，可能是過度透水引起；塘泥、育苗土單獨使用不適合移栽，原因可能與其不透水性有關(guān)。因此，適合的移栽基質(zhì)需要具備保水而又不過度積水的特性，這樣方可更好地滿足組培苗的移栽需求。本研究從通城虎莖段無菌材料的獲得、芽誘導(dǎo)、繼代增殖及生根、移栽等整個過程，首次成功建立了通城虎帶芽莖段的組培再生體系，為通城虎的工廠化育苗及遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。