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        豐花月季杏花村組培快繁條件篩選

        2021-11-29 05:24:14任杰林榕榕王燕梁靜萍黎經(jīng)田李可貴陳冠銘李宏楊劉揚(yáng)
        熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年10期
        關(guān)鍵詞:生長(zhǎng)

        任杰 林榕榕 王燕 梁靜萍 黎經(jīng)田 李可貴陳冠銘 李宏楊 劉揚(yáng)

        (1三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院 海南三亞 572000;2海南玫瑰谷產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司 海南三亞 572000;3三亞市熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 海南三亞 572000;4海南熱帶海洋學(xué)院 海南三亞 572000)

        月季(Rosa chinensis)是薔薇科薔薇屬的一種常綠或半常綠灌木,顏色多樣,有濃郁的香味,形態(tài)各有特點(diǎn),受到國(guó)內(nèi)外人的喜愛。月季在中國(guó)已有2 000年的栽培歷史[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),現(xiàn)代月季品種約有24 000種[2],杏花村屬于現(xiàn)代月季品種之一的豐花月季(Floribunda Roses),又稱聚花月季,1935年Drior用Kirsten Penlsen×Unamed seedling作為親本育出。其適應(yīng)能力強(qiáng),長(zhǎng)勢(shì)好,易管理,花開艷麗,常用于園林綠植。海南三亞的亞龍灣國(guó)際玫瑰谷與三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院合作,對(duì)杏花村引種栽培,發(fā)現(xiàn)其適合三亞的氣候環(huán)境,但因三亞夏季高溫高濕天氣影響,常規(guī)的扦插、壓條、嫁接等繁殖方式成活率低、病毒積累嚴(yán)重。阻礙其推廣示范,育苗難問(wèn)題亟待解決。

        早在1980年,Hasegawa[3]就在MS培養(yǎng)基上成功培育出攀援月季Improvedfire,證明組培月季可行。組培外植體的選擇通常為生長(zhǎng)健壯、芽點(diǎn)飽滿的枝條,少數(shù)也采用葉片[4-7]、葉柄[4,8]、葉盤[8]做外植體。在李海燕等[9]研究中,中部莖段腋芽效果最好,平均萌發(fā)時(shí)間比頂部和基部芽短6~8 d。其次是基部,再是頂部[9-13]。

        適宜濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能有效促進(jìn)月季腋芽的誘導(dǎo)。Rout等[14]進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)時(shí),發(fā)現(xiàn)6-BA的正常有效濃度為0.5~3.0 mg/L。Bressan[10]在研究Gold Glow時(shí),發(fā)現(xiàn)當(dāng)6-BA量超過(guò)0.3 mg/L會(huì)對(duì)側(cè)芽萌發(fā)起到明顯的抑制,且NAA的有效濃度為 0.01~0.5 mg/L[15-16]。錢蕾[17]在對(duì)粉-A 初代培養(yǎng)研究中,添加6-BA 2.0 mg/L和NAA 0.05 mg/L,誘導(dǎo)率為94.61%。莫磊興等[18]研究結(jié)果表明,高溫會(huì)影響芽的萌發(fā),26℃左右最適芽的萌發(fā)。

        在腋芽的增殖研究中發(fā)現(xiàn),0.1~3.0 mg/L為6-BA的正常有效濃度,0.3 mg/L為IBA的最優(yōu)有效濃度,0.005~0.500 mg/L為NAA的合理有效濃度[19]。6-BA低濃度最適于促進(jìn)腋芽的增殖,高濃度則會(huì)抑制腋芽生長(zhǎng)發(fā)育。NAA的濃度高低會(huì)影響芽增殖速度,NAA濃度在0.1 mg/L以上時(shí),腋芽增殖率會(huì)明顯降低[20]。其次,腋芽的增殖還會(huì)受環(huán)境因子、糖濃度、pH等多項(xiàng)因子的影響。莫磊興等[18]研究發(fā)現(xiàn),隨著光照強(qiáng)度的提高,玻璃化的現(xiàn)象慢慢減緩,光照在3 000 lx左右腋芽的增殖培養(yǎng)率會(huì)得到有效提高。培養(yǎng)基的糖濃度與pH高低影響繼代的生長(zhǎng)周期,因此,月季培養(yǎng)基中的糖含量不得超過(guò)50 g/L,pH必須低于5.5。

        生根培養(yǎng)通常采用1/2 MS培養(yǎng)基。Hyndman等[21]認(rèn)為,MS培養(yǎng)基中的氮鹽比與無(wú)機(jī)鹽相同,但高濃度氮鹽對(duì)生根有抑制作用,生根主要利用NAA、IBA、IAA等生長(zhǎng)素,且NAA常用有效濃度為0.01~1.00 mg/L,IBA有效濃度為0.01~1.00mg/L,IAA使用則相對(duì)較少。李正平[22]將ATB用于月季組織培養(yǎng)的研究,發(fā)現(xiàn)生根的有效濃度為0.5~10.0 mg/L,生根的較佳濃度為0.5~2.0 mg/L。何松林等[23]將IBA、IAA和NAA添加在薩蔓莎生根培養(yǎng)基中,結(jié)果證明3種激素均能促進(jìn)生根,且效果最佳的配方是:1/2 MS+I(xiàn)BA 0.5 mg/L、1/2 MS+I(xiàn)AA 1.0 mg/L與1/2 MS+NAA 0.5 mg/L。另外,在培養(yǎng)基中加入適量的活性炭能有效吸附有毒物質(zhì)及沉淀。姚曉惠等[24]研究發(fā)現(xiàn),月季組織培養(yǎng)的生根階段還受較多環(huán)境因子的影響,溫度為21℃時(shí)生根的長(zhǎng)勢(shì)最好;且日光燈更適于月季的生根。

        月季組培技術(shù)相對(duì)成熟,已有許多優(yōu)良月季品種如卡羅拉、多情玫瑰、金太陽(yáng)、芳純?cè)录镜榷喾N研究對(duì)象及成果[25],為月季快繁技術(shù)研究提供參考。本文在前人研究的基礎(chǔ)上,對(duì)豐花月季杏花村進(jìn)行組培快繁試驗(yàn),使其具有優(yōu)良遺傳特性和表型特性,同時(shí)縮短育種周期,以解決三亞地區(qū)月季育苗難問(wèn)題,并建立適合三亞的月季組培育苗技術(shù)體系。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        外植體材料取自亞龍灣國(guó)際玫瑰谷,采健壯、芽點(diǎn)飽滿的杏花村枝條作為材料。試驗(yàn)在三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院的組培快繁實(shí)驗(yàn)室及大棚中完成。

        1.2 方法

        1.2.1 外植體處理

        外植體材料的處理:將采樣枝條進(jìn)行2 h的流水沖洗,隨后分別將各芽點(diǎn)剪成5 cm左右莖段,莖段含1~2個(gè)芽點(diǎn),外植體在超凈工作臺(tái)下用洗滌劑消毒2次。消毒:先用75%酒精浸泡3 min,用無(wú)菌水濕潤(rùn)3次,再用0.1%氯化汞浸泡15 min,加一滴吐溫,輕輕攪拌,然后用無(wú)菌水潤(rùn)洗5遍。消毒完畢,進(jìn)行接種試驗(yàn),將消毒好的莖段處理至1 cm左右的長(zhǎng)度,各個(gè)莖段都含有一個(gè)芽點(diǎn),相接種至培養(yǎng)基中。

        1.2.2 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)

        1.2.2.1 啟動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基

        現(xiàn)選用WPM、MS、1/2 MS 3種培養(yǎng)基類型,添加0.5 mg/L的山農(nóng)(外植體型)抑制污染,且每次選用30個(gè)芽節(jié)用于以下培養(yǎng)基進(jìn)行水平正交試驗(yàn):(1) 空白對(duì)照;(2) WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L;(3) WPM+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;(4)WPM+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2 mg/L;(5) 1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;(6)1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L;(7)1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L;(8)MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;(9)MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L;(10)MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L。

        1.2.2.2 腋芽增殖培養(yǎng)基

        將誘導(dǎo)長(zhǎng)出的健壯新芽莖段通過(guò)無(wú)菌操作進(jìn)行切割,接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。選用WPM培養(yǎng)基,添加6-BA、NAA、GA3和IBA四種植物生長(zhǎng)激素,進(jìn)行水平正交試驗(yàn),每次接種30株新芽,且添加0.5 mL/L山農(nóng)(外植體型)抑制污染。(1)空白對(duì)照;(2) WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;(3) WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L;(4)WPM+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;(5) WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;(6) WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L+GA30.5 mg/L; (7)WPM+6-BA 2.0 mg/L+I(xiàn)BA 0.02 mg/L;(8) WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+GA30.05 mg/L;(9)WPM+6-BA 1.0 mg/L+I(xiàn)BA 0.2 mg/L。

        1.2.2.3 生根培養(yǎng)基

        采用WPM培養(yǎng)基,添加NAA、GA3、IBA三種植物生長(zhǎng)激素,以及0.5 mL/L山農(nóng)(內(nèi)生菌型)抑制污染,和0.1 g/L ACO誘導(dǎo)根系生長(zhǎng)。設(shè)計(jì)水平正交試驗(yàn),每次試驗(yàn)使用30株增殖獲得的健壯無(wú)根苗。(1)空白對(duì)照;(2)WPM+NAA 0.1 mg/L+I(xiàn)BA 0.1 mg/L;(3) WPM+ NAA 0.2 mg/L+ IBA 0.2 mg/L;(4) WPM+GA30.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+I(xiàn)BA 0.1 mg/L;(5) WPM+ GA30.1 mg/L+ NAA 0.1 mg/L;(6)WPM+ GA30.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+I(xiàn)BA 0.2 mg/L;(7) WPM+ GA30.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+ IBA 0.2 mg/L;(8)WPM+ GA30.5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+I(xiàn)BA 0.1 mg/L;(9) WPM+ GA30.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;

        1.2.2.4 煉苗移栽

        將生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)健壯并且根部發(fā)育良好的組培苗,從無(wú)菌培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移至溫室大棚,進(jìn)行為期一周煉苗。一周后打開培養(yǎng)瓶瓶蓋,將組培苗取出用500~600倍的多菌靈溶液浸泡10 min,且洗凈根部殘留的培養(yǎng)基。然后放在陰涼通風(fēng)處?kù)o置晾干3~5 min,再移栽至蛭石中觀察15 d,記錄其生長(zhǎng)過(guò)程及成活率[15]。

        1.2.3 數(shù)據(jù)處理

        用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)歸納整理,用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同培養(yǎng)基組合對(duì)杏花村腋芽誘導(dǎo)的影響

        從表1的正交試驗(yàn)可知,不同植物生長(zhǎng)素濃度配比對(duì)杏花村月季初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的各處理間差異顯著。結(jié)果表明,生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)腋芽的誘導(dǎo)有一定的作用。其中WPM+6-BA 1.0+NAA 0.1 mg/L效果最為顯著。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L,NAA濃度為0.1 mg/L時(shí),葉片綠而健壯無(wú)愈傷,生長(zhǎng)良好,誘導(dǎo)率較高,而外植體在無(wú)任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中,雖能夠誘導(dǎo)腋芽發(fā)芽,但生長(zhǎng)狀況一般,芽個(gè)數(shù)較少、誘導(dǎo)率較低。當(dāng)培養(yǎng)基配方中的6-BA濃度為2.0和0.5 mg/L,NAA濃度為0.2和0.05 mg/L時(shí),雖誘導(dǎo)腋芽的生長(zhǎng),但是植株生長(zhǎng)狀況一般,葉黃較多,生長(zhǎng)勢(shì)弱,說(shuō)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度過(guò)高或過(guò)低,不僅不利于腋芽分化,還可能抑制植株的正常生長(zhǎng),使葉片變黃。3種培養(yǎng)基類型中MS培養(yǎng)基最適宜植株生長(zhǎng),植株生長(zhǎng)狀況較好,葉綠,高大健壯,但芽苗個(gè)數(shù)較少,誘導(dǎo)率較低。月季品種間的基因型各異和培養(yǎng)基配方有差異,不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)月季的腋芽誘導(dǎo)起不同作用。根據(jù)誘導(dǎo)的平均芽數(shù)和生長(zhǎng)狀況來(lái)看,WPM+6-BA1.0mg/L+NAA 0.1 mg/L是杏花村腋芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基(圖1)。

        圖1 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程

        表1 不同培養(yǎng)基組合腋芽誘導(dǎo)的影響

        2.2 不同培養(yǎng)基組合對(duì)杏花村腋芽增殖的影響

        由表2可看出,杏花村月季的腋芽增殖效果差異顯著。WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L的增殖效果較好,增殖率顯著高于其他處理,植株長(zhǎng)得好,葉綠,產(chǎn)生的愈傷較少,成活率高。而腋芽在無(wú)任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中,雖然能增殖,但生長(zhǎng)比較差,葉黃,成活率極低。6-BA+NAA+GA3處理增殖效果較6-BA+NAA和6-BA+I(xiàn)BA差,葉黃,愈傷多,成活率低。結(jié)合芽的增殖率、成活率和生長(zhǎng)狀況看,WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L為最適合的腋芽增殖培養(yǎng)基(圖2)。

        圖2 腋芽增殖培養(yǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程

        表2 不同培養(yǎng)基組合腋芽增殖的影響

        2.3 不同培養(yǎng)基組合對(duì)杏花村腋芽生根的影響

        由表3可以看出,不同濃度的激素配比對(duì)杏花村月季的腋芽生根效果的差異顯著。其中WPM+GA30+NAA 0.2 mg/L+I(xiàn)BA 0.2 mg/L,培養(yǎng)配方的效果最為顯著。從方差分析情況看,當(dāng)IBA濃度為0.2 mg/L、NAA濃度為0.02 mg/L時(shí),腋芽的平均根數(shù)為2.05根,平均株高為0.68 cm。相比其他處理,腋芽生長(zhǎng)良好,葉片翠綠,高大健壯,根系發(fā)達(dá),成活率高。而腋芽在無(wú)任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中,雖可以達(dá)到生根的效果,但生長(zhǎng)一般,較健壯,葉較綠,根系較發(fā)達(dá)。而WPM+GA30.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+I(xiàn)BA 0.1 mg/L植株生長(zhǎng)狀況較差,生長(zhǎng)勢(shì)弱,葉黃,根系不發(fā)達(dá),大面積死亡成活率低。根據(jù)腋芽的平均株高、平均根數(shù)、成活率和生長(zhǎng)狀況來(lái)看,最適合腋芽生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為WPM+NAA0.2mg/L+I(xiàn)BA0.2mg/L(圖3)。

        表3 不同培養(yǎng)基組合腋芽生根的影響

        圖3 腋芽生根培養(yǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程

        2.4 組培苗馴化成活率

        以蛭石為基質(zhì),組培苗放在室外培養(yǎng),隨著時(shí)間的變化,適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境的植株,將會(huì)長(zhǎng)出新葉,葉片數(shù)為2~3片,后期生長(zhǎng)健壯會(huì)長(zhǎng)出叢生芽,生長(zhǎng)勢(shì)較弱的植株會(huì)慢慢表現(xiàn)出葉片枯黃,根部發(fā)黑。煉苗一周后,成活率為90%左右;煉苗兩周后,成活率為70%左右。說(shuō)明豐花月季杏花村組培苗在三亞移栽馴化具有可行性。

        3 討論與結(jié)論

        本試驗(yàn)研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)豐花月季杏花村的腋芽誘導(dǎo)、增殖以及生根的影響。外植體的消毒處理與無(wú)菌操作在組培試驗(yàn)中尤為重要,與吳林森等[26]提出的觀點(diǎn)相同。本試驗(yàn)在外植體的消毒階段,另使用了山農(nóng)試劑對(duì)枝條中存在的細(xì)小毛刺進(jìn)行消毒處理,可更大程度上抑制污染發(fā)生。

        在試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基最適宜植株生長(zhǎng)發(fā)育,與閆海霞等[27]研究認(rèn)為WPM最適宜植株生長(zhǎng)的觀點(diǎn)不一致。結(jié)果表明,WPM誘導(dǎo)時(shí)間相對(duì)MS要慢一些,植株的健壯程度相比MS稍差,但WPM的誘導(dǎo)率相對(duì)于MS誘導(dǎo)率更高。因此,腋芽的誘導(dǎo)選用MS培養(yǎng)基也可行。進(jìn)行腋芽的誘導(dǎo)時(shí),添加2 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA,會(huì)在一定程度上使植物葉片枯黃且長(zhǎng)勢(shì)弱;將6-BA濃度調(diào)為1 mg/L、NAA濃度調(diào)為0.1 mg/L時(shí),腋芽的誘導(dǎo)生長(zhǎng)最佳。由此可見,試驗(yàn)中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA與NAA的有效濃度范圍與 Rout[16]和 Bressan[11]的研究相符。增殖階段中使用GA3效果并不理想,植株生長(zhǎng)狀況差,死亡多,葉片黃,愈傷多;IBA則對(duì)腋芽的增殖有一定的促進(jìn)效果。由此可見,進(jìn)行月季腋芽的增殖時(shí),GA3并不適合,IBA則可行,但相比而言,使用低濃度的6-BA和NAA更適于月季腋芽的增殖。在生根階段由于發(fā)生溫度變高導(dǎo)致根部變黑的情況,從而影響植株的正常生長(zhǎng)。這與姚曉惠等[24]研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致,生根階段受溫度變化的影響較為顯著,其最適溫度為21℃。因此,本試驗(yàn)中,將溫度控制在20~25℃,從而避免溫度變化的影響。最后進(jìn)行移栽培養(yǎng)時(shí),經(jīng)多次反復(fù)移栽觀察后,豐花月季杏花村組培苗在蛭石基質(zhì)中生長(zhǎng)良好,成活率明顯較高。

        綜上所述,豐花月季杏花村最適宜腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為WPM+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;最適合腋芽增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L;最適宜生根的培養(yǎng)基為WPM+NAA 0.2 mg/L+I(xiàn)BA 0.2 mg/L;組培苗馴化以蛭石為基質(zhì),在室外培養(yǎng)觀察15 d,存活率為50%。

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