任杰 林榕榕 王燕 梁靜萍 黎經(jīng)田 李可貴陳冠銘 李宏楊 劉揚(yáng)

(1三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院 海南三亞 572000;2海南玫瑰谷產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司 海南三亞 572000;3三亞市熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 海南三亞 572000;4海南熱帶海洋學(xué)院 海南三亞 572000)

月季（Rosa chinensis）是薔薇科薔薇屬的一種常綠或半常綠灌木，顏色多樣，有濃郁的香味，形態(tài)各有特點(diǎn)，受到國(guó)內(nèi)外人的喜愛。月季在中國(guó)已有2 000年的栽培歷史［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)代月季品種約有24 000種［2］，杏花村屬于現(xiàn)代月季品種之一的豐花月季（Floribunda Roses），又稱聚花月季，1935年Drior用Kirsten Penlsen×Unamed seedling作為親本育出。其適應(yīng)能力強(qiáng)，長(zhǎng)勢(shì)好，易管理，花開艷麗，常用于園林綠植。海南三亞的亞龍灣國(guó)際玫瑰谷與三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院合作，對(duì)杏花村引種栽培，發(fā)現(xiàn)其適合三亞的氣候環(huán)境，但因三亞夏季高溫高濕天氣影響，常規(guī)的扦插、壓條、嫁接等繁殖方式成活率低、病毒積累嚴(yán)重。阻礙其推廣示范，育苗難問(wèn)題亟待解決。

早在1980年，Hasegawa［3］就在MS培養(yǎng)基上成功培育出攀援月季Improvedfire，證明組培月季可行。組培外植體的選擇通常為生長(zhǎng)健壯、芽點(diǎn)飽滿的枝條，少數(shù)也采用葉片［4-7］、葉柄［4，8］、葉盤［8］做外植體。在李海燕等［9］研究中，中部莖段腋芽效果最好，平均萌發(fā)時(shí)間比頂部和基部芽短6～8 d。其次是基部，再是頂部［9-13］。

適宜濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能有效促進(jìn)月季腋芽的誘導(dǎo)。Rout等［14］進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)時(shí)，發(fā)現(xiàn)6-BA的正常有效濃度為0.5～3.0 mg/L。Bressan［10］在研究Gold Glow時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)6-BA量超過(guò)0.3 mg/L會(huì)對(duì)側(cè)芽萌發(fā)起到明顯的抑制，且NAA的有效濃度為 0.01～0.5 mg/L［15-16］。錢蕾［17］在對(duì)粉-A 初代培養(yǎng)研究中，添加6-BA 2.0 mg/L和NAA 0.05 mg/L，誘導(dǎo)率為94.61%。莫磊興等［18］研究結(jié)果表明，高溫會(huì)影響芽的萌發(fā)，26℃左右最適芽的萌發(fā)。

在腋芽的增殖研究中發(fā)現(xiàn)，0.1～3.0 mg/L為6-BA的正常有效濃度，0.3 mg/L為IBA的最優(yōu)有效濃度，0.005～0.500 mg/L為NAA的合理有效濃度［19］。6-BA低濃度最適于促進(jìn)腋芽的增殖，高濃度則會(huì)抑制腋芽生長(zhǎng)發(fā)育。NAA的濃度高低會(huì)影響芽增殖速度，NAA濃度在0.1 mg/L以上時(shí)，腋芽增殖率會(huì)明顯降低［20］。其次，腋芽的增殖還會(huì)受環(huán)境因子、糖濃度、pH等多項(xiàng)因子的影響。莫磊興等［18］研究發(fā)現(xiàn)，隨著光照強(qiáng)度的提高，玻璃化的現(xiàn)象慢慢減緩，光照在3 000 lx左右腋芽的增殖培養(yǎng)率會(huì)得到有效提高。培養(yǎng)基的糖濃度與pH高低影響繼代的生長(zhǎng)周期，因此，月季培養(yǎng)基中的糖含量不得超過(guò)50 g/L，pH必須低于5.5。

生根培養(yǎng)通常采用1/2 MS培養(yǎng)基。Hyndman等［21］認(rèn)為，MS培養(yǎng)基中的氮鹽比與無(wú)機(jī)鹽相同，但高濃度氮鹽對(duì)生根有抑制作用，生根主要利用NAA、IBA、IAA等生長(zhǎng)素，且NAA常用有效濃度為0.01～1.00 mg/L，IBA有效濃度為0.01～1.00mg/L，IAA使用則相對(duì)較少。李正平［22］將ATB用于月季組織培養(yǎng)的研究，發(fā)現(xiàn)生根的有效濃度為0.5～10.0 mg/L，生根的較佳濃度為0.5～2.0 mg/L。何松林等［23］將IBA、IAA和NAA添加在薩蔓莎生根培養(yǎng)基中，結(jié)果證明3種激素均能促進(jìn)生根，且效果最佳的配方是：1/2 MS＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L、1/2 MS＋I(xiàn)AA 1.0 mg/L與1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L。另外，在培養(yǎng)基中加入適量的活性炭能有效吸附有毒物質(zhì)及沉淀。姚曉惠等［24］研究發(fā)現(xiàn)，月季組織培養(yǎng)的生根階段還受較多環(huán)境因子的影響，溫度為21℃時(shí)生根的長(zhǎng)勢(shì)最好；且日光燈更適于月季的生根。

月季組培技術(shù)相對(duì)成熟，已有許多優(yōu)良月季品種如卡羅拉、多情玫瑰、金太陽(yáng)、芳純?cè)录镜榷喾N研究對(duì)象及成果［25］，為月季快繁技術(shù)研究提供參考。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)豐花月季杏花村進(jìn)行組培快繁試驗(yàn)，使其具有優(yōu)良遺傳特性和表型特性，同時(shí)縮短育種周期，以解決三亞地區(qū)月季育苗難問(wèn)題，并建立適合三亞的月季組培育苗技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

外植體材料取自亞龍灣國(guó)際玫瑰谷，采健壯、芽點(diǎn)飽滿的杏花村枝條作為材料。試驗(yàn)在三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院的組培快繁實(shí)驗(yàn)室及大棚中完成。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

外植體材料的處理：將采樣枝條進(jìn)行2 h的流水沖洗，隨后分別將各芽點(diǎn)剪成5 cm左右莖段，莖段含1～2個(gè)芽點(diǎn)，外植體在超凈工作臺(tái)下用洗滌劑消毒2次。消毒：先用75%酒精浸泡3 min，用無(wú)菌水濕潤(rùn)3次，再用0.1%氯化汞浸泡15 min，加一滴吐溫，輕輕攪拌，然后用無(wú)菌水潤(rùn)洗5遍。消毒完畢，進(jìn)行接種試驗(yàn)，將消毒好的莖段處理至1 cm左右的長(zhǎng)度，各個(gè)莖段都含有一個(gè)芽點(diǎn)，相接種至培養(yǎng)基中。

1.2.2 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)

1.2.2.1 啟動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基

現(xiàn)選用WPM、MS、1/2 MS 3種培養(yǎng)基類型，添加0.5 mg/L的山農(nóng)（外植體型）抑制污染，且每次選用30個(gè)芽節(jié)用于以下培養(yǎng)基進(jìn)行水平正交試驗(yàn)：（1） 空白對(duì)照；（2） WPM＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；（3） WPM＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（4）WPM＋6-BA2.0mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（5） 1/2 MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（6）1/2MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.05mg/L；（7）1/2MS＋6-BA2.0mg/L＋NAA0.2mg/L；（8）MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（9）MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.1mg/L；（10）MS＋6-BA2.0mg/L＋NAA0.05mg/L。

1.2.2.2 腋芽增殖培養(yǎng)基

將誘導(dǎo)長(zhǎng)出的健壯新芽莖段通過(guò)無(wú)菌操作進(jìn)行切割，接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。選用WPM培養(yǎng)基，添加6-BA、NAA、GA3和IBA四種植物生長(zhǎng)激素，進(jìn)行水平正交試驗(yàn)，每次接種30株新芽，且添加0.5 mL/L山農(nóng)（外植體型）抑制污染。（1）空白對(duì)照；（2） WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（3） WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L；（4）WPM＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（5） WPM＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（6） WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L＋GA30.5 mg/L； （7）WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.02 mg/L；（8） WPM＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋GA30.05 mg/L；（9）WPM＋6-BA 1.0 mg/L＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L。

1.2.2.3 生根培養(yǎng)基

采用WPM培養(yǎng)基，添加NAA、GA3、IBA三種植物生長(zhǎng)激素，以及0.5 mL/L山農(nóng)（內(nèi)生菌型）抑制污染，和0.1 g/L ACO誘導(dǎo)根系生長(zhǎng)。設(shè)計(jì)水平正交試驗(yàn)，每次試驗(yàn)使用30株增殖獲得的健壯無(wú)根苗。（1）空白對(duì)照；（2）WPM＋NAA 0.1 mg/L＋I(xiàn)BA 0.1 mg/L；（3） WPM＋ NAA 0.2 mg/L＋ IBA 0.2 mg/L；（4） WPM＋GA30.1 mg/L＋NAA 0.05 mg/L＋I(xiàn)BA 0.1 mg/L；（5） WPM＋ GA30.1 mg/L＋ NAA 0.1 mg/L；（6）WPM＋ GA30.1 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L；（7） WPM＋ GA30.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L＋ IBA 0.2 mg/L；（8）WPM＋ GA30.5 mg/L＋ NAA 0.1 mg/L＋I(xiàn)BA 0.1 mg/L；（9） WPM＋ GA30.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；

1.2.2.4 煉苗移栽

將生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)健壯并且根部發(fā)育良好的組培苗，從無(wú)菌培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移至溫室大棚，進(jìn)行為期一周煉苗。一周后打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，將組培苗取出用500～600倍的多菌靈溶液浸泡10 min，且洗凈根部殘留的培養(yǎng)基。然后放在陰涼通風(fēng)處?kù)o置晾干3～5 min，再移栽至蛭石中觀察15 d，記錄其生長(zhǎng)過(guò)程及成活率［15］。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)歸納整理，用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基組合對(duì)杏花村腋芽誘導(dǎo)的影響

從表1的正交試驗(yàn)可知，不同植物生長(zhǎng)素濃度配比對(duì)杏花村月季初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的各處理間差異顯著。結(jié)果表明，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)腋芽的誘導(dǎo)有一定的作用。其中WPM＋6-BA 1.0＋NAA 0.1 mg/L效果最為顯著。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L，NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，葉片綠而健壯無(wú)愈傷，生長(zhǎng)良好，誘導(dǎo)率較高，而外植體在無(wú)任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中，雖能夠誘導(dǎo)腋芽發(fā)芽，但生長(zhǎng)狀況一般，芽個(gè)數(shù)較少、誘導(dǎo)率較低。當(dāng)培養(yǎng)基配方中的6-BA濃度為2.0和0.5 mg/L，NAA濃度為0.2和0.05 mg/L時(shí)，雖誘導(dǎo)腋芽的生長(zhǎng)，但是植株生長(zhǎng)狀況一般，葉黃較多，生長(zhǎng)勢(shì)弱，說(shuō)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度過(guò)高或過(guò)低，不僅不利于腋芽分化，還可能抑制植株的正常生長(zhǎng)，使葉片變黃。3種培養(yǎng)基類型中MS培養(yǎng)基最適宜植株生長(zhǎng)，植株生長(zhǎng)狀況較好，葉綠，高大健壯，但芽苗個(gè)數(shù)較少，誘導(dǎo)率較低。月季品種間的基因型各異和培養(yǎng)基配方有差異，不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)月季的腋芽誘導(dǎo)起不同作用。根據(jù)誘導(dǎo)的平均芽數(shù)和生長(zhǎng)狀況來(lái)看，WPM＋6-BA1.0mg/L＋NAA 0.1 mg/L是杏花村腋芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基（圖1）。

圖1 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程

表1 不同培養(yǎng)基組合腋芽誘導(dǎo)的影響

2.2 不同培養(yǎng)基組合對(duì)杏花村腋芽增殖的影響

由表2可看出，杏花村月季的腋芽增殖效果差異顯著。WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L的增殖效果較好，增殖率顯著高于其他處理，植株長(zhǎng)得好，葉綠，產(chǎn)生的愈傷較少，成活率高。而腋芽在無(wú)任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中，雖然能增殖，但生長(zhǎng)比較差，葉黃，成活率極低。6-BA＋NAA＋GA3處理增殖效果較6-BA＋NAA和6-BA＋I(xiàn)BA差，葉黃，愈傷多，成活率低。結(jié)合芽的增殖率、成活率和生長(zhǎng)狀況看，WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L為最適合的腋芽增殖培養(yǎng)基（圖2）。

圖2 腋芽增殖培養(yǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程

表2 不同培養(yǎng)基組合腋芽增殖的影響

2.3 不同培養(yǎng)基組合對(duì)杏花村腋芽生根的影響

由表3可以看出，不同濃度的激素配比對(duì)杏花村月季的腋芽生根效果的差異顯著。其中WPM＋GA30＋NAA 0.2 mg/L＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L，培養(yǎng)配方的效果最為顯著。從方差分析情況看，當(dāng)IBA濃度為0.2 mg/L、NAA濃度為0.02 mg/L時(shí)，腋芽的平均根數(shù)為2.05根，平均株高為0.68 cm。相比其他處理，腋芽生長(zhǎng)良好，葉片翠綠，高大健壯，根系發(fā)達(dá)，成活率高。而腋芽在無(wú)任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中，雖可以達(dá)到生根的效果，但生長(zhǎng)一般，較健壯，葉較綠，根系較發(fā)達(dá)。而WPM＋GA30.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L＋I(xiàn)BA 0.1 mg/L植株生長(zhǎng)狀況較差，生長(zhǎng)勢(shì)弱，葉黃，根系不發(fā)達(dá)，大面積死亡成活率低。根據(jù)腋芽的平均株高、平均根數(shù)、成活率和生長(zhǎng)狀況來(lái)看，最適合腋芽生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為WPM＋NAA0.2mg/L＋I(xiàn)BA0.2mg/L（圖3）。

表3 不同培養(yǎng)基組合腋芽生根的影響

圖3 腋芽生根培養(yǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程

2.4 組培苗馴化成活率

以蛭石為基質(zhì)，組培苗放在室外培養(yǎng)，隨著時(shí)間的變化，適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境的植株，將會(huì)長(zhǎng)出新葉，葉片數(shù)為2～3片，后期生長(zhǎng)健壯會(huì)長(zhǎng)出叢生芽，生長(zhǎng)勢(shì)較弱的植株會(huì)慢慢表現(xiàn)出葉片枯黃，根部發(fā)黑。煉苗一周后，成活率為90%左右；煉苗兩周后，成活率為70%左右。說(shuō)明豐花月季杏花村組培苗在三亞移栽馴化具有可行性。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)豐花月季杏花村的腋芽誘導(dǎo)、增殖以及生根的影響。外植體的消毒處理與無(wú)菌操作在組培試驗(yàn)中尤為重要，與吳林森等［26］提出的觀點(diǎn)相同。本試驗(yàn)在外植體的消毒階段，另使用了山農(nóng)試劑對(duì)枝條中存在的細(xì)小毛刺進(jìn)行消毒處理，可更大程度上抑制污染發(fā)生。

在試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基最適宜植株生長(zhǎng)發(fā)育，與閆海霞等［27］研究認(rèn)為WPM最適宜植株生長(zhǎng)的觀點(diǎn)不一致。結(jié)果表明，WPM誘導(dǎo)時(shí)間相對(duì)MS要慢一些，植株的健壯程度相比MS稍差，但WPM的誘導(dǎo)率相對(duì)于MS誘導(dǎo)率更高。因此，腋芽的誘導(dǎo)選用MS培養(yǎng)基也可行。進(jìn)行腋芽的誘導(dǎo)時(shí)，添加2 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA，會(huì)在一定程度上使植物葉片枯黃且長(zhǎng)勢(shì)弱；將6-BA濃度調(diào)為1 mg/L、NAA濃度調(diào)為0.1 mg/L時(shí)，腋芽的誘導(dǎo)生長(zhǎng)最佳。由此可見，試驗(yàn)中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA與NAA的有效濃度范圍與 Rout［16］和 Bressan［11］的研究相符。增殖階段中使用GA3效果并不理想，植株生長(zhǎng)狀況差，死亡多，葉片黃，愈傷多；IBA則對(duì)腋芽的增殖有一定的促進(jìn)效果。由此可見，進(jìn)行月季腋芽的增殖時(shí)，GA3并不適合，IBA則可行，但相比而言，使用低濃度的6-BA和NAA更適于月季腋芽的增殖。在生根階段由于發(fā)生溫度變高導(dǎo)致根部變黑的情況，從而影響植株的正常生長(zhǎng)。這與姚曉惠等［24］研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致，生根階段受溫度變化的影響較為顯著，其最適溫度為21℃。因此，本試驗(yàn)中，將溫度控制在20～25℃，從而避免溫度變化的影響。最后進(jìn)行移栽培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)多次反復(fù)移栽觀察后，豐花月季杏花村組培苗在蛭石基質(zhì)中生長(zhǎng)良好，成活率明顯較高。

綜上所述，豐花月季杏花村最適宜腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為WPM＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；最適合腋芽增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L；最適宜生根的培養(yǎng)基為WPM＋NAA 0.2 mg/L＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L；組培苗馴化以蛭石為基質(zhì)，在室外培養(yǎng)觀察15 d，存活率為50%。