李佳 楊曉麗 楊小丹 田洋 白忠彬

(1云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院 云南昆明 650201;2云南省生物大數(shù)據(jù)重點實驗室 云南昆明 650201)

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科屬草本植物，又稱鐵皮蘭、黑節(jié)草。因其喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環(huán)境［1］，秦嶺、淮河以南的皖、浙以及云、貴、川等地成為了中國鐵皮石斛的主要分布地［2］。由于野生鐵皮石斛生長條件的特殊性和分布的局限性，又經(jīng)長期采挖，自然資源瀕臨枯竭，國內(nèi)市場供應(yīng)緊缺。鐵皮石斛又被稱為“九大仙草之首”，味甘、性微寒，在《本草綱目》中記載“石斛氣平，味甘、淡、微咸，陰中之陽，降也”［3］，即鐵皮石斛有補腎臟、調(diào)理脾胃、滋陰補陽、補養(yǎng)臟腑、清熱除痹、延年益壽之功效［4-5］。

鐵皮石斛中含有多種功能活性物質(zhì)，主要有多糖、氨基酸類、生物堿和多種微量元素［6-8］。多糖是糖類在自然界中的主要存在形式，有些多糖具有某種特殊的生理活性稱為活性多糖。多糖是鐵皮石斛主要功效成分，且含量較高；根據(jù)現(xiàn)代藥理學研究，鐵皮石斛多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖及其他作用（抑菌、促進毛發(fā)生長、抗衰老、降血壓等）［9-10］，因此在功能性食品、藥品和化妝品行業(yè)中具有良好的發(fā)展前景［11-13］。云南林下仿生鐵皮石斛功能活性成分含量較市場上所售石斛高，營養(yǎng)更為豐富，因此，研究其活性成分高效、便捷的提取工藝，對于中國鐵皮石斛的市場開發(fā)有重要意義。本研究通過單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計對鐵皮石斛多糖的提取工藝進行優(yōu)化，使用熱水浸提法來提取鐵皮石斛多糖，結(jié)合苯酚-硫酸法［11］測定鐵皮石斛多糖含量，再用Box-Behnken組合設(shè)計試驗方案來優(yōu)化分離純化條件［12-14］，旨在為鐵皮石斛多糖的功能活性研究奠定基礎(chǔ)，進而為鐵皮石斛今后的市場發(fā)展提供有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鐵皮石斛

云南省普洱市斛哥莊園，為仿野生林下鐵皮石斛。

1.1.2 試劑

硫酸（重慶川東化工有限公司），苯酚（Aladdin），無水乙醇（天津市風船化學試劑科技有限公司），正己烷（重慶川東化工有限公司），正丁醇（重慶川東化工有限公司），三氯甲烷（重慶川東化工有限公司），無水葡萄糖（廣東光華科技股份有限公司），所有有機試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

FA1004N分析天平（上海精密科學儀器有限公司），HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市華普達數(shù)學儀器有限公司），IUV-5100紫外-可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SC-36低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），F(xiàn)D-1A-50真空冷凍干燥機（上海比郎儀器制造有限公司），F(xiàn)L-2Y電爐（上海力辰邦西儀器科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 鐵皮石斛多糖的提取

1.2.1.1 原料的選擇和處理

取林下仿生鐵皮石斛鮮條切段，每段長度0.5～1.0 cm，稱取鐵皮石解鮮條段300.000g，于60℃恒溫干燥2～3 d；將烘干后的鐵皮石斛磨碎成粉，過100目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 鐵皮石斛脫脂

用分析天平準確稱取鐵皮石斛粉末25.000g，加入5倍體積的正己烷，用磁力攪拌器攪拌48h后用濾紙過濾；往濾渣中再加入5倍體積的95%乙醇攪拌48 h后過濾；將濾渣放入陶瓷盤子中自然風干。

1.2.1.3 多糖提取

用分析天平準確稱取鐵皮石斛粉未5.000 g，加入裝有400mL蒸餾水的500mL燒杯中，打開電爐墊石棉網(wǎng)加熱至95～100℃提取，溶液沸騰時開始計時（2 h）；冷卻至室溫后用6層紗布過濾，加400mL蒸餾水對濾渣重復浸提2次，依次進行過濾操作。

1.2.1.4 提取液處理

合并上述3次經(jīng)過濾的多糖提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（56～60℃）上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至200 mL左右。Sevage法除蛋白：在多糖溶液中加入1/4的Sevage試劑（正丁醇∶三氯甲烷＝1∶4，V∶V），于搖床上30min，離心去除水層與溶劑層之間的變性蛋白層，重復操作6～8次，直至無變性蛋白析出。

1.2.1.5 冷凍干燥

量取經(jīng)脫蛋白處理的多糖溶液，加入4倍體積95%乙醇，于4℃冰箱靜置12 h后進行離心，以轉(zhuǎn)速3500 r/min處理10 min；棄去上清液收集沉淀，將沉淀放入凍干盤中置于-80℃冰箱預冷凍；將已凍結(jié)的多糖真空冷凍干燥3～4 d，研磨成粉，裝入離心管或自封袋，即得鐵皮石解多糖粉末樣品。

1.2.2 鐵皮石斛多糖含量的測定

1.2.2.1 標準曲線的繪制

精確稱取0.500 g干燥至恒重的無水葡萄糖，配制成濃度為0.100 mg/mL的標準溶液；取11支試管，分別加入 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL標準溶液，補齊蒸餾水體積至2.0 mL；加入5%苯酚溶液1.000 mL，搖勻，再加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，沸水浴煮沸15 min，以流動水冷卻至室溫后在490nm處測量吸光度；以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線（圖1）。

圖1 苯酚-硫酸法檢測標準曲線

1.2.2.2 苯酚-硫酸法測定鐵皮石斛多糖含量

準確量取待檢測多糖溶液1.0mL于10.0mL具塞試管中，加水至2.0 mL，按標準曲線的制備方法，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，震蕩搖勻，加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴15 min后，以流動水沖洗至室溫，在紫外分光光度計490nm波長處測定吸光度；從標準曲線上讀出樣品溶液中鐵皮石斛多糖濃度，通過多糖含量的計算方法計算鐵皮石斛多糖含量、純度及提取率。

式中：C表示標準曲線上讀出的多糖濃度（mg/mL）；C母表示樣品濃度，0.1 mg/mL；F表示樣品稀釋倍數(shù)（100倍）；0.91表示葡萄糖的校正系數(shù)。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計

1.2.3.1 液料比對鐵皮石斛多糖含量的影響

稱取5.000 g的鐵皮石斛粉末，以液料比為自變量做單因素試驗。固定多糖提取條件為提取溫度95℃、提取時間1.5h、提取次數(shù)3次，考察液料比20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1 （mL/g）對鐵皮石斛多糖含量的影響。

1.2.3.2 提取次數(shù)對鐵皮石斛多糖含量的影響

稱取5.000 g的鐵皮石斛粉末，以提取次數(shù)為自變量做單因素試驗。固定多糖提取條件為提取溫度95℃、液料比80∶1（mL/g）、提取時間1.5h，考察提取次數(shù)1、2、3、4、5次對鐵皮石斛多糖含量的影響。

1.2.3.3 提取時間對鐵皮石斛多糖含量的影響

稱取5.000 g的鐵皮石斛粉末，以提取時間為自變量做單因素試驗。固定其他提取條件為液料比80∶1（mL/g）、提取次數(shù)3次、提取溫度95℃，考察提取時間1.0、1.5、2、2.5、3.0 h對鐵皮石斛多糖含量的影響。

1.2.3.4 提取溫度對鐵皮石斛多糖含量的影響

稱取5.000 g的鐵皮石斛粉末，以提取溫度為自變量做單因素試驗。固定多糖提取條件為液料比80∶1（mL/g）、提取時間1.5 h、提取次數(shù)3次，考察提取溫度60、70、80、90、95℃對多糖含量的影響。

1.2.4 Box-Behnken設(shè)計試驗方案

在單因素的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件進行試驗設(shè)計，研究各參數(shù)對考察指標的影響規(guī)律，并得到最優(yōu)提取條件。以提取溫度、提取時間、液料比和提取次數(shù)為自變量，以鐵皮石斛多糖含量為響應(yīng)值，其因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因子水平及編碼

1.2.5 鐵皮石斛多糖理化指標檢測

采用GB/T 5009.3—2016標準規(guī)定的方法檢測多糖中的水分［15］，多糖中灰分按GB/T 5009.4—2016規(guī)定方法檢測［16］。

1.2.6 鐵皮石斛多糖中無機元素含量測定

按GB/T 5009.91—2017規(guī)定的方法檢測多糖中鉀元素［17］；按GB/T 5009.13—2017規(guī)定的方法檢測多糖中銅元素［18］；按GB/T 5009.241—2017規(guī)定的方法檢測多糖中鎂元素［19］；按GB/T 5009.14—2017規(guī)定的方法檢測多糖中鋅元素［20］；按GB/T 5009.92—2016規(guī)定的方法檢測多糖中鈣元素［21］；按GB/T 5009.93—2017規(guī)定的方法檢測多糖中硒元素［22］；按GB/T 5009.242—2017規(guī)定的方法檢測多糖中錳元素［23］。

1.2.7 鐵皮石斛多糖中氨基酸成分檢測

多糖中氨基酸含量按GB/T 5009.124—2016規(guī)定的方法檢測［24］。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)為3次重復平均值，采用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，SPSS 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析；利用Design-Expert 8.0研究液料比、提取溫度、提取時間及提取次數(shù)對鐵皮石斛多糖含量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對鐵皮石斛多糖含量的影響

圖2顯示，液料比在20∶1和40∶1時，鐵皮石斛多糖含量較低。原因是由于20∶1和40∶1時，液料比過低而多糖提取溶液濃度過高，多糖還粘附在鐵皮石斛表面，過濾時將多糖隨鐵皮石斛殘渣濾掉，導致多糖含量降低。液料比增加到60∶1時，鐵皮石斛多糖含量顯著上升，是因為隨料液的增加多糖提取比較充分，但由于經(jīng)過粗純化的多糖其溶解性好，因此隨著液料比的增加，多糖在后續(xù)的過濾過程中有所損失，導致含量下降。因此，液料比60∶1為鐵皮石斛多糖提取的最適液料比。

圖2 液料比對鐵皮石斛多糖含量的影響

2.1.2 提取次數(shù)對鐵皮石斛多糖含量的影響

圖3顯示，提取次數(shù)1～2次鐵皮石斛含量顯著下降。提取1～2次不足以將多糖提取完全，造成多糖大量損失；當提取到3次時，多糖含量提取比較完全；提取次數(shù)超過3次以后鐵皮石斛多糖含量逐漸下降，可能是提取次數(shù)過多，多糖因粘帶濾渣被過濾掉而導致含量下降。在提取次數(shù)為3次時鐵皮石斛多糖含量最高，因此3次為鐵皮石斛多糖提取的最適提取次數(shù)。

圖3 提取次數(shù)對鐵皮石斛多糖含量的影響

2.1.3 提取時間對鐵皮石斛多糖含量的影響

圖4顯示，提取時間對鐵皮石斛多糖含量的影響比較大。提取時間為3.0h時鐵皮石斛多糖含量最低，2.5 h時最高，鐵皮石斛多糖需要一定時間才能夠完全溶出。因此，提取時間2.5h為鐵皮石斛多糖的最適提取時間。

圖4 提取時間對鐵皮石斛多糖含量的影響

2.1.4 提取溫度對鐵皮石斛多糖含量的影響

圖5顯示，隨著提取溫度的不斷增加，鐵皮石斛多糖含量也在明顯增大，提取溫度在90℃時鐵皮石斛多糖含量最高，之后多糖含量又有所下降，是由于多糖在高溫下發(fā)生部分水解［25］。

圖5 提取溫度對鐵皮石斛多糖含量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗

基于單因素試驗分析，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計四因子三水平的響應(yīng)面分析試驗，試驗方案根據(jù)表1的因子與水平設(shè)計，所得響應(yīng)面的試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

從響應(yīng)面的設(shè)計及試驗結(jié)果，獲得以鐵皮石斛多糖含量為響應(yīng)值的二次回歸方程為：

Y＝91.19＋4.72A-3.63B＋5C－4.28D-0.45AB＋1.22AC＋4.93AD＋4.36BC－8.65BD－0.12CD－15.51A2＋4.42B2－10.56C2－11.11D2

回歸模型方差分析見表3。利用方差分析結(jié)果建立的回歸模型p＜0.000 1，達到極顯著水平，得出R2＝0.928 5，Radj2＝0.845 1，說明模型能夠較好地反映響應(yīng)值的變化；失擬項（p＝1）不顯著，說明回歸模型和預測值之間有較好擬合度。

表3 回歸模型方差分析

通過液料比、提取次數(shù)、提取時間、提取溫度的試驗設(shè)計優(yōu)化，得到相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析。二次方程回歸系數(shù)的顯著性表明，因素C（提取溫度）（p＜0.010）、A（液料比）（p＜0.010）對鐵皮石斛多糖含量提取效應(yīng)極顯著；因素B（提取時間）（p＜0.050）、因素D（提取時間）（p＜0.050）對鐵皮石斛多糖含量提取影響顯著；交互項BD對鐵皮石斛多糖含量提取影響顯著，其余交互項影響均不顯著；二次項A2、C2、D2（p＜0.010）對鐵皮石斛多糖含量提取影響極顯著。各因素對多糖含量的影響順序：提取次數(shù)二次項＞提取溫度二次項＞提取時間和提取次數(shù)交互項＝提取溫度一次項＞液料比一次項＞提取次數(shù)一次項＞提取時間一次項＞提取時間二次項＞液料比和提取次數(shù)交互項＞提取時間和提取溫度交互項＞液料比和提取溫度交互項＞液料比和提取時間交互項＞提取溫度和提取次數(shù)交互項。

根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面和等高線（圖6～11），從各個因素交互作用對響應(yīng)面進行分析，響應(yīng)面等高線圖可直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，以便找出最佳工藝參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用，等高線中最小橢圓的中心點即為響應(yīng)面的最高點。

圖6 提取時間與液料比對鐵皮石斛多糖含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖7 提取溫度與液料比對鐵皮石斛多糖含量影響的響應(yīng)面圖和等高線

圖8 提取次數(shù)與液料比對鐵皮石斛多糖含量影響的響應(yīng)面圖和等高線

圖9 提取溫度與提取時間對鐵皮石斛多糖含量影響的響應(yīng)面和等高線

圖10 提取次數(shù)與提取時間對鐵皮石斛多糖含量影響的響應(yīng)面圖和等高線

圖11 提取次數(shù)與提取溫度對鐵皮石斛多糖含量影響的響應(yīng)面圖和等高線

等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。響應(yīng)面圖中曲線越彎曲，說明研究因素對結(jié)果影響越大，等高線呈橢圓形說明研究因素之間的交互作用顯著，呈圓形則說明交互作用不顯著。通過三維圖，觀察曲面的傾斜度，確定二者對響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高即坡度越陡，說明二者交互作用越顯著。從響應(yīng)面和等高線圖可以看出，提取溫度與液料比的交互作用對鐵皮石斛多糖含量提取的影響最顯著。

2.3 驗證試驗

通過響應(yīng)面方法的設(shè)計，得到鐵皮石斛多糖提取的最佳條件為：液料比61.48∶1，提取時間2.02h，提取溫度88.96℃，提取次數(shù)3.13次，預測的多糖含量為99.09%。但由于實際操作條件的限制，將提取的最優(yōu)提取工藝設(shè)置為：提取溫度90℃，提取時間2.5h，液料比60∶1，提取次數(shù)3次。在此條件下提取率為32%，多糖含量的理論預測值為98.63%。在此條件下進行試驗驗證，得到的多糖提取率接近35%，同時3次試驗測得的多糖含量平均值為85.33%。因此，響應(yīng)面法對鐵皮石斛多糖提取條件的優(yōu)化是穩(wěn)定可行的。

2.4 鐵皮石斛多糖的成分分析

通過檢測鐵皮石斛多糖粉末中影響其理化性質(zhì)的成分可知，其水分含量為7.39%，灰分含量達到3.56%，由于進行了凍干，因此水分含量較少，溶解后的多糖溶液較為粘稠。

無機元素檢測結(jié)果顯示，鐵皮石斛多糖中無機元素的總量為1.39%，其中K含量0.231%，Cu含量0.042%，Mg含量0.087%，Zn含量0.007%，Ca含量1.01%，Mn含量0.013%，Se含量0.003%。鐵皮石斛多糖中富含無機鹽，可以維持機體正常的生命活動，比如Ca含量較高，可以有效地防治骨質(zhì)疏松；Zn可以提高機體的免疫力等。

經(jīng)檢測可知，鐵皮石斛多糖中含有16種氨基酸，其中包括7種成人必需氨基酸，9種非必需氨基酸，見表4。

表4 鐵皮石斛多糖中氨基酸含量

3 討論與結(jié)論

鐵皮石斛多糖的提取方法主要有傳統(tǒng)熱水浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶輔助提取法、超臨界輔助提取法等［26］。不同工藝對多糖成品的質(zhì)量、結(jié)構(gòu)、活性以及提取率均有很大的影響。本研究主要探討了鐵皮石斛的液料比、提取次數(shù)、提取溫度和提取時間對多糖含量提取的影響，在40∶1～100∶1對液料比進行優(yōu)化，當液料比為40∶1時，由于溶劑較少，鐵皮石斛多糖無法完全提取，所以多糖含量較低，結(jié)合實際操作過程認為，液料比在60∶1時提取多糖最優(yōu)。在提取次數(shù)不斷增加時，鐵皮石斛中的多糖含量逐漸減小，并在提取次數(shù)為3次時多糖含量最高。通過對鐵皮石斛提取時間進行研究發(fā)現(xiàn)，隨提取時間延長，多糖含量有所減少，提取時間在2.5 h時效果良好。提取溫度在60～90℃時，多糖含量隨提取溫度的提高逐漸增加，在100℃時又明顯下降，因此最適提取溫度為90℃。通過響應(yīng)面優(yōu)化鐵皮石斛多糖的分離粗純化條件，鐵皮石斛多糖提取的最優(yōu)條件為提取溫度90℃，提取時間2.5h，液料比60∶1，提取次數(shù)3次；在此條件下提取率接近35%，多糖含量為85.33%。與李程程等［27］提取效果基本吻合。

本研究對鐵皮石斛粉末進行脫脂處理，并對鐵皮石斛提取液進行透析以除去小分子物質(zhì)及鹽類，經(jīng)醇沉冷凍干燥后，根據(jù)多糖含量計算方法，得到鐵皮石斛多糖純度為85.33%。通過對鐵皮石斛多糖組分中的灰分、水分以及無機元素、氨基酸進行分析可知，其水分含量為7.39%，灰分含量達到3.56%，無機元素的總量為1.39%，氨基酸總量為0.67%，含16種氨基酸，包括7種成年人必需氨基酸和9種非必需氨基酸。由此可見，在本試驗條件下提取到的鐵皮石斛多糖富含人體必需氨基酸，且礦物質(zhì)含量豐富，商業(yè)價值更高。