李 麗，任 民，王飛清

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 貴陽(yáng) 550001）

肺炎鏈球菌屬于鏈球菌屬，為革蘭陽(yáng)性菌，其菌體外有莢膜。兒童、老年人、免疫力低下或存在免疫缺陷的人群均易感染該菌。一般情況下，肺炎鏈球菌定植于鼻腔黏膜中，不引起疾病癥狀。在某些誘因的作用下，該菌可穿透鼻腔黏膜，通過血管內(nèi)皮屏障進(jìn)入肺部、血液中甚至腦部，從而可引發(fā)肺炎、敗血癥及腦膜炎等嚴(yán)重的感染性疾病[1-2]。由肺炎鏈球菌感染所致肺炎、腦膜炎、中耳炎等疾病的發(fā)病率均較高[3]。但該菌引發(fā)上述疾病的分子機(jī)制至今尚不明確。構(gòu)建穩(wěn)定的肺炎鏈球菌致病動(dòng)物模型可為臨床上研究肺炎鏈球菌感染的分子機(jī)制、防治由該菌所致的疾病提供參考依據(jù)。構(gòu)建動(dòng)物模型的關(guān)鍵在于動(dòng)物的選擇。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，利用感染肺炎鏈球菌的大鼠、家兔等動(dòng)物無法構(gòu)建穩(wěn)定的動(dòng)物模型。小鼠是建立肺炎鏈球菌感染動(dòng)物模型的最佳選擇[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體在被病原菌感染后，會(huì)產(chǎn)生多種炎癥因子、趨化因子和急性時(shí)相蛋白，如C- 反應(yīng)蛋白（c-reaction protein，CRP）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等。它們?cè)谘褐袧舛鹊淖兓闆r可反映機(jī)體發(fā)生感染的情況[7]。在本次實(shí)驗(yàn)中，我院采用經(jīng)鼻腔滴注和經(jīng)腹腔注射兩種感染途徑構(gòu)建肺炎鏈球菌小鼠模型，對(duì)比經(jīng)不同的感染途徑構(gòu)建的肺炎鏈球菌小鼠模型，其體征、血清CRP、TNF-α、IL-1、IL-6 等感染性指標(biāo)的變化情況及其肺組織病理切片的情況，以期為臨床上選擇不同的感染途徑構(gòu)建肺炎鏈球菌小鼠模型及研究肺炎鏈球菌的致病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取40 只體重在30 ～35 g 之間的清潔級(jí)雄性昆明小鼠〔由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（黔）2018-0001 〕。飼養(yǎng)小鼠的環(huán)境溫度為20℃～25℃，濕度為60% 左右，飲食方式為自由飲食，按照每隔12 h 進(jìn)行明暗交替的方式進(jìn)行飼養(yǎng)。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施（倫理審查批準(zhǔn)文號(hào)：1305020），所有的實(shí)驗(yàn)操作均符合動(dòng)物倫理保護(hù)協(xié)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC49619），購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 主要儀器及試劑

電子天平（由美國(guó)雙杰兄弟有限公司提供）、二氧化碳培養(yǎng)箱（品牌：美國(guó)Thermo，型號(hào)：Forma Series Ⅱ）、顯微鏡（品牌：日本OLYMPUS，型號(hào)：CX23）、VITEK MS 全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（由法國(guó)生物梅里埃公司提供）、酶標(biāo)儀（品牌：普朗，型號(hào)：DNM-9606）、DensiCHEK plus 比濁儀（由法國(guó)生物梅里埃公司提供）、酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（由南京建成生物科技有限公司提供）、90 mm 哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)基（由法國(guó)生物梅里埃公司提供）、奧普托欣藥敏紙片（由OXOID 公司提供）、二甲苯（由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供）。

1.4 研究方法

1.4.1 小鼠模型的構(gòu)建方法 對(duì)40 只清潔級(jí)小鼠進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將其隨機(jī)分為鼻腔組、腹腔組、鼻腔對(duì)照組及腹腔對(duì)照組，每組各10 只小鼠。對(duì)四組小鼠均采用自由飲用自來水及飼料的方式進(jìn)行飼養(yǎng)。將經(jīng)過純培養(yǎng)的肺炎鏈球菌用無菌生理鹽水沖洗制備成菌懸液，再用麥?zhǔn)媳葷醿x將其配置成1.0 個(gè)麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，確保菌懸液中細(xì)菌的計(jì)數(shù)為3×108 CFU/mL。為鼻腔組小鼠采用經(jīng)鼻腔滴注的方式接種菌懸液，為腹腔組小鼠采用經(jīng)腹腔注射的方式接種菌懸液，每只小鼠均接種150 μL 的菌懸液。同時(shí)為鼻腔對(duì)照組小鼠經(jīng)鼻腔滴注無菌生理鹽水（150 μL/只），為腹腔對(duì)照組小鼠經(jīng)腹腔注射無菌生理鹽水（150 μL/只）。注藥完畢后，每隔2 h 觀察1 次鼻腔組和腹腔組小鼠的發(fā)病情況，并記錄觀察的時(shí)間。

1.4.2 對(duì)鼻腔組與腹腔組小鼠模型體內(nèi)的致病菌進(jìn)行分離與鑒定的方法 在鼻腔組小鼠感染肺炎鏈球菌72 h、腹腔組小鼠感染肺炎鏈球菌12 ～14 h 后，分別采集兩組小鼠適量的血液標(biāo)本和肺組織，接種在哥倫比亞血瓊脂平板上。在溫度為35 ℃、二氧化碳濃度為5%的環(huán)境下對(duì)血瓊脂平板進(jìn)行18 ～24 h 的孵育后，形成直徑為0.5 ～1.5 mm、灰色、細(xì)小、圓形（扁平）、表面光滑、中央呈臍窩狀、周圍有草綠色溶血環(huán)的菌落。挑取單個(gè)的典型菌落，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。采用革蘭染色法、奧普托欣敏感試驗(yàn)和質(zhì)譜儀對(duì)純化后的菌株進(jìn)行鑒定。

1.4.3 對(duì)小鼠模型進(jìn)行血清炎癥因子檢測(cè)的方法 在鼻腔組小鼠感染肺炎鏈球菌72 h、腹腔組小鼠感染肺炎鏈球菌12 ～14 h 后，采用濃度為10% 的水合氯醛對(duì)四組小鼠進(jìn)行麻醉，采用眼球取血法將其處死，并收集其全血。將其全血標(biāo)本置入EP 管（一種小型離心管）中。按照3500 r/min 的轉(zhuǎn)速對(duì)小鼠的全血標(biāo)本進(jìn)行10 min 的離心處理后，吸取血清標(biāo)本。將血清標(biāo)本放置在2℃～8℃的環(huán)境下保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)小鼠血清炎癥因子（包括CRP、TNF-α、IL-1 和IL-6）的水平，在吸取血清標(biāo)本后4 h 內(nèi)完成檢測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.4.4 對(duì)小鼠模型的肺組織進(jìn)行病理學(xué)檢查的方法 在用眼球取血法為四組小鼠取血后，迅速取其肺組織，將其肺組織放置在濃度為10% 的多聚甲醛溶液中固定3 d。對(duì)肺組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片（厚度為5 μm）處理，并用蘇木精- 伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin staining，HE）進(jìn)行染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織發(fā)生炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的程度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本次研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，兩兩比較用最小顯著差數(shù)法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺炎鏈球菌小鼠模型構(gòu)建成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)

在鼻腔組和腹腔組小鼠發(fā)病后，采用革蘭染色法對(duì)其致病菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，其致病菌株為革蘭陽(yáng)性球菌。該菌呈矛頭狀，成雙排列，或呈短鏈狀排列（見圖1）。采用奧普托欣敏感試驗(yàn)對(duì)兩組小鼠的致病菌株進(jìn)行鑒定的結(jié)果顯示，其致病菌株抑菌圈的直徑≥14 mm，表明其致病菌株對(duì)奧普托欣試驗(yàn)敏感（見圖1）。采用VITEK MS 質(zhì)譜儀對(duì)兩組小鼠的致病菌株進(jìn)行鑒定的結(jié)果顯示，其致病菌株為肺炎鏈球菌，該鑒定結(jié)果的可信度為99.9%（見圖2）。以上的鑒定結(jié)果表明，兩組小鼠的致病菌株均為肺炎鏈球菌。采用經(jīng)鼻腔滴注和經(jīng)腹腔注射兩種感染途徑構(gòu)建肺炎鏈球菌小鼠模型均獲得成功。

2.2 四組小鼠體征的變化情況

在四組小鼠注藥完畢后，鼻腔對(duì)照組和腹腔對(duì)照組小鼠的精力充沛，活動(dòng)及飲食正常，其毛色光澤鮮艷，均未發(fā)生死亡。鼻腔組小鼠在滴注肺炎鏈球菌20 h 后開始出現(xiàn)打噴嚏等癥狀，其精神逐漸萎靡、活動(dòng)減少、食欲降低，蜷縮成團(tuán)、豎毛。在注藥72 h 后，該組小鼠不再進(jìn)食，其面部開始腫脹，閉眼，此時(shí)采用眼球取血法將其處死。從注藥到處死的過程中，鼻腔組小鼠均未發(fā)生死亡。腹腔組小鼠在接種肺炎鏈球菌4 ～6 h 后開始出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡不振、進(jìn)食量逐漸減少的現(xiàn)象，且蜷縮成團(tuán)，被毛簇起。隨后，該組小鼠出現(xiàn)不同程度的呼吸急促，其進(jìn)食及活動(dòng)停止，部分小鼠開始出現(xiàn)閉眼的癥狀，其面部腫脹、脫毛。在注藥12 ～14 h 后，該組小鼠中有5 只小鼠死亡，此時(shí)，采用眼球取血法處死剩余的5 只小鼠。

2.3 四組小鼠血清炎癥因子水平的對(duì)比

與鼻腔對(duì)照組、腹腔對(duì)照組小鼠相比，鼻腔組和腹腔組小鼠血清CRP、TNF-α、IL-1 和IL-6 的水平均較高，P＜0.001。與鼻腔組小鼠相比，腹腔組小鼠血清CRP、TNF-α、IL-1 和IL-6 的水平均較高，P＜0.001。詳見表1。

表1 四組小鼠血清炎癥因子水平的對(duì)比（± s ）

表1 四組小鼠血清炎癥因子水平的對(duì)比（± s ）

注：a 與鼻腔對(duì)照組、腹腔對(duì)照組相比，P ＜0.001；b 與鼻腔組相比，P ＜0.001。

炎癥因子 鼻腔對(duì)照組 腹腔對(duì)照組 鼻腔組 腹腔組 F 值 P 值CRP（μg/mL） 7.98±3.15 7.86±2.97 32.22±8.28a 70.96±16.43ab 59.425 ＜0.001 TNF-α（pg/mL） 5.09±2.86 5.13±2.63 59.91±18.75a 206.24±42.29ab 138.965 ＜0.001 IL-1（pg/mL） 28.98±13.50 29.12±11.32 141.61±42.67a 277.18±32.73ab 88.939 ＜0.001 IL-6（pg/mL） 44.05±8.54 46.57±8.05 317.36±85.73a 513.50±78.95ab 93.683 ＜0.001

2.4 對(duì)四組小鼠的肺組織切片進(jìn)行病理檢查的結(jié)果

對(duì)四組小鼠的肺組織切片進(jìn)行病理檢查的結(jié)果顯示，鼻腔對(duì)照組和腹腔對(duì)照組小鼠肺泡組織的結(jié)構(gòu)及輪廓清晰，其肺泡腔內(nèi)無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)生。腹腔組小鼠肺泡組織的結(jié)構(gòu)及輪廓模糊，其肺泡腔內(nèi)發(fā)生炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的程度嚴(yán)重，并引發(fā)肺組織損傷。鼻腔組小鼠肺泡組織的部分輪廓及結(jié)構(gòu)模糊，其肺組織周圍出現(xiàn)少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且浸潤(rùn)的程度輕于腹腔組小鼠（見圖3）。

圖3 四組小鼠肺組織的病理切片

3 討論

近年來，隨著多重耐藥菌感染現(xiàn)象的不斷發(fā)生，肺炎鏈球菌感染的發(fā)病機(jī)制、快速診斷方法逐漸成為臨床上研究的熱點(diǎn)。構(gòu)建穩(wěn)定的肺炎鏈球菌動(dòng)物模型可為肺炎鏈球菌感染機(jī)制、療效評(píng)價(jià)等方面的實(shí)驗(yàn)研究提供保障。在本次研究中，我院選擇昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，構(gòu)建經(jīng)臨床常見途徑感染的肺炎鏈球菌小鼠模型，以探討經(jīng)鼻腔滴注和經(jīng)腹腔注射兩種感染途徑對(duì)肺炎鏈球菌小鼠機(jī)體的影響，建立肺炎鏈球菌感染動(dòng)物模型的制備標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而為提高肺炎鏈球菌小鼠模型的穩(wěn)定性，深入研究肺炎鏈球菌感染的分子機(jī)制提供參考。

通過進(jìn)行本次研究可知，與經(jīng)鼻腔滴注感染肺炎鏈球菌的小鼠相比，經(jīng)腹腔注射感染肺炎鏈球菌的小鼠發(fā)病急、感染程度嚴(yán)重。可見，經(jīng)腹腔注射的感染途徑較適宜構(gòu)建急重度肺炎鏈球菌感染動(dòng)物模型。經(jīng)鼻腔滴注的感染途徑主要用于研究肺部感染。而且，經(jīng)該途徑構(gòu)建的肺炎鏈球菌小鼠模型病程進(jìn)展緩慢、發(fā)生感染的程度易被控制，可根據(jù)需求開展相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。研究表明，患者機(jī)體對(duì)細(xì)菌的免疫反應(yīng)情況決定了其感染肺炎鏈球菌后最終的轉(zhuǎn)歸情況[8-9]。在患者感染肺炎鏈球菌的早期，其機(jī)體中的TNF-α、IL-1、IL-6 等促炎因子作為炎癥及免疫應(yīng)答體系中的重要介質(zhì)，均呈高表達(dá)的狀態(tài)[10-11]。TNF-α 可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的黏附、游走和浸潤(rùn)，并釋放大量的活性氧自由基、蛋白水解酶、脂類介質(zhì)及細(xì)胞因子[12]。IL-1 和IL-6 可促進(jìn)細(xì)胞的分化發(fā)育，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能，并可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)肝組織合成CRP 等急性時(shí)相蛋白[3、13]。CRP是一種非特異性炎癥因子，在機(jī)體發(fā)生感染時(shí)，其含量可急劇上升，且其水平的變化早于體溫、血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化。另外，該指標(biāo)不受抗菌藥物、免疫抑制劑、腎上腺皮質(zhì)激素的影響，是監(jiān)測(cè)感染、評(píng)估組織損傷的常用指標(biāo)[14-15]。通過進(jìn)行本次研究可知，采用經(jīng)腹腔注射的感染途經(jīng)構(gòu)建的肺炎鏈球菌小鼠模型，其發(fā)生感染的程度重于采用經(jīng)鼻腔滴注的感染途徑構(gòu)建的肺炎鏈球菌小鼠模型。其原因可能與腹腔感染可導(dǎo)致機(jī)體的炎癥反應(yīng)和與抗炎反應(yīng)失衡，進(jìn)而可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生病理性損傷有關(guān)[16]。

綜上所述，經(jīng)鼻腔滴注、腹腔注射兩種感染途徑構(gòu)建的肺炎鏈球菌小鼠模型，其發(fā)病時(shí)間、死亡情況、血清炎癥因子的水平及肺組織發(fā)生病理?yè)p傷的程度均存在明顯的差異。構(gòu)建穩(wěn)定的肺炎鏈球菌感染動(dòng)物模型是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。在本次實(shí)驗(yàn)中，肺炎鏈球菌小鼠模型的成功構(gòu)建可進(jìn)一步輔助臨床上診斷、治療肺炎鏈球菌感染，改善發(fā)生感染患者的預(yù)后。