林璐，周甜甜，郝赤子，廖維靖

血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是第二常見的癡呆類型，占癡呆病人的15%左右[1]。VaD的患病風(fēng)險(xiǎn)大約每3～5年增加一倍[2]，隨著我國人口老齡化，VaD患病人數(shù)將大幅上升。認(rèn)知障礙與跌倒的發(fā)生密切相關(guān)[3]，對患者安全造成極大威脅。雖然部分治療阿爾茲海默病的藥物能改善VaD癥狀，但仍面臨耐藥性和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重的問題。VaD主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶缺陷。海馬的損傷是認(rèn)知缺陷的主要原因。研究表明，神經(jīng)炎癥抑制海馬神經(jīng)發(fā)生，導(dǎo)致VaD認(rèn)知障礙[4-5]。最近的研究指出，抑制炎癥可以緩解嚙齒類低灌注模型的行為缺陷[4]。星形膠質(zhì)細(xì)胞參與介導(dǎo)VaD海馬神經(jīng)炎癥，占大腦所有膠質(zhì)細(xì)胞的20%～40%[6]。腦損傷時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞迅速作出反應(yīng)并發(fā)展為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。豐富環(huán)境(enriched environment，EE)具有神經(jīng)保護(hù)作用，已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，例如卒中[7-8]，阿爾茲海默癥和腦損傷[9]。此外，研究表明EE能夠提高海馬相關(guān)學(xué)習(xí)和記憶任務(wù)的表現(xiàn)，對老年大鼠的海馬功能有顯著作用[11-13]。但是，很少證據(jù)表明EE能夠減輕VaD的神經(jīng)炎癥。此外，探究EE、VaD神經(jīng)炎癥和星形膠質(zhì)細(xì)胞三者關(guān)系的研究更是寥寥無幾。本研究探索EE對VaD大鼠神經(jīng)炎癥和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用，旨在為臨床治療VaD提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 成年Sprague-Dawley雄性大鼠購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。所有大鼠居住在SPF級環(huán)境(4只/籠，22～24℃，12h晝夜循環(huán)，相對濕度50%～60%)，提供充足的飲用水和食物。所有的實(shí)驗(yàn)步驟均獲武漢大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No：2019130)。分組前排除怕水、活動(dòng)緩慢的大鼠。36只大鼠隨機(jī)分3組：假手術(shù)組，模型組和模型+EE組，每組12只。見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間線

1.2 方法 ①制作動(dòng)物模型：模型組和模型+ EE組均接受永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)(2-vessel elusion，2-VO)，過程參照Du等[11-13]的所述。使用10%水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉大鼠，將其固定在加熱墊上，直腸溫度保持在37～38℃。沿頸正中線切開，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，使之與迷走神經(jīng)分離，結(jié)扎該側(cè)頸總動(dòng)脈近端和遠(yuǎn)端并從中間剪斷。用同樣的方式結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行相同的手術(shù)流程，但沒有結(jié)扎頸總動(dòng)脈。所有大鼠術(shù)后3d均生活在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，并進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測模型是否成功。模型成功率為88.9%(成功24只，死亡3只)。②環(huán)境干預(yù)：EE和標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下的大鼠均可自由飲水和進(jìn)食。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境使用正常尺寸的籠子(44 cm×32 cm×20 cm，4只/籠)。EE籠(90 cm×75 cm×50 cm，12只/籠)配備許多玩具，包括跑輪、各式PVC管道、秋千、臺(tái)階和彩色的海洋球、鈴鐺及串珠，每天變換這些玩具的位置。模型+EE組大鼠在EE籠中活動(dòng)4h/d(8：00～12：00)，其余時(shí)間居于標(biāo)準(zhǔn)籠。干預(yù)自術(shù)后第4天始，持續(xù)28d。

1.3 評定標(biāo)準(zhǔn) ①M(fèi)orris水迷宮用于評估大鼠的學(xué)習(xí)及空間記憶能力[16]：干預(yù)期后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，具體操作如前所述[17]。前五天進(jìn)行定向航行訓(xùn)練，大鼠面朝池壁，每天從四個(gè)象限分別入水一次，記錄大鼠尋找平臺(tái)所花時(shí)間。若60s內(nèi)未找到平臺(tái)，便將大鼠引導(dǎo)至平臺(tái)處并停留20s，逃避潛伏期記為“60s”。第6天空間探索測試時(shí)將移走平臺(tái)，大鼠從東南象限入水，記錄60s內(nèi)大鼠在西北象限花費(fèi)的時(shí)間、穿越原平臺(tái)的次數(shù)及游泳速度。數(shù)據(jù)由動(dòng)物視頻跟蹤分析系統(tǒng)(Anilab科學(xué)儀器有限公司，寧波，中國)記錄。②采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase deoxyuridine triphosphate nick end labeling，TUNEL)染色(試劑盒11684817910，Roche)檢測海馬細(xì)胞凋亡：VaD海馬CA1錐體神經(jīng)元易損傷是認(rèn)知障礙發(fā)生的關(guān)鍵[18]。如前所述[17]，將4μm厚切片脫蠟、破膜后，浸入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶( terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT )：脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate ，dUTP)=1：9的反應(yīng)混合物中，37°C水浴鍋孵育60 min，PBS(pH = 7.4)洗滌3次。用4′，6 -二脒基- 2 -苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole ，DAPI，AS1075，Wuhan)覆蓋切片上，室溫孵育5min，洗凈后在熒光顯微鏡下觀察。用Image-Image-Pro Plus計(jì)定量海馬CA1區(qū)的TUNEL陽性細(xì)胞，每個(gè)樣本選取3個(gè)視野(×400)并求平均值。③實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測海馬白細(xì)胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)：IL-1β是一種細(xì)胞因子，在細(xì)胞活化、增殖和分化中起主要作用[19]。如前所述[17]，使用TRIpure(EP013，ELK Biotechnology)從海馬組織中提取RNA。采用EntiLinkTM第一鏈cDNA合成試劑盒(EQ003，ELK Biotechnology)合成第一鏈cDNA。使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒(EQ001，ELK Biotechnology)和tepOneTMReal-Time PCR儀(Life Technologies公司)進(jìn)行檢測。用2-ΔΔCT分析RT-qPCR檢測的基因表達(dá)相對變化。β-actin作為內(nèi)參。cDNA序列如下：β-actin 上游為5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′(110)，下游為5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′(110)。 IL-1β 上游為5′-ATGAAAGACGGCACACCCAC-3′(156)，下游為5′-GGTGCTGATGTACCAGTTGGG-3′(156)。④免疫熒光雙標(biāo)法標(biāo)記海馬的星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2(lipocalin-2，LCN2)：GFAP和LCN2的上調(diào)是出現(xiàn)為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物[20-21]。LCN2作為反應(yīng)性星形膠質(zhì)的自分泌因子，參與調(diào)節(jié)VaD的神經(jīng)炎癥[21]。4μm厚的海馬石蠟冠狀切片脫蠟后，依次加入50μl稀釋的一抗(GFAP(1∶300)、LCN2(1∶100))和二抗。隨后每個(gè)切片滴加50 μl DAPI染色液，室溫避光孵育5min后滴加適量的抗熒光淬滅劑，在熒光顯微鏡下觀察(OLYMPUS， IX51)。用成像系統(tǒng)(MicroPublisher，Q-IMAGING)定量IOD/面積，每個(gè)切片取3個(gè)視野(500μm×500μm)并求平均值。

2 結(jié)果

2.1 EE對大鼠學(xué)習(xí)和空間記憶能力的影響 環(huán)境干預(yù)28d后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。從定向航行訓(xùn)練的第2天開始，模型組的逃避潛伏期明顯長于假手術(shù)組(P<0.05)，第3天開始模型組的逃避潛伏期也比模型+EE組更長(P<0.05)，這種差異一直持續(xù)到定向航行訓(xùn)練的第5天。雖然模型+EE組大鼠的逃避潛伏期在訓(xùn)練中不斷縮短，但始終高于假手術(shù)組(P<0.05)。見表1。在水迷宮實(shí)驗(yàn)的第6天的空間探索測試中。模型組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間少于假手術(shù)組(P<0.05)，也少于模型+EE組(P<0.05)，模型+EE組和假手術(shù)組之間的差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；此外，3組穿越原平臺(tái)的次數(shù)也大有不同(P<0.05)，假手術(shù)組穿越次數(shù)最多，其次是模型+EE組，模型組最少；3組2-VO大鼠平均游泳速度的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 干預(yù)28d后3組大鼠逃避潛伏期的比較

表2 干預(yù)28d后3組大鼠在空間探索測試中的比較

2.2 EE對大鼠海馬神經(jīng)元的影響 Tunel染色的結(jié)果顯示，干預(yù)28d后，模型組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡的數(shù)量遠(yuǎn)大于假手術(shù)組(P<0.05)，模型+EE組神經(jīng)元凋亡的數(shù)量明顯小于模型組(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)。見圖2,表3。

圖2 干預(yù)28d后3組大鼠海馬CAI區(qū)神經(jīng)元凋亡比較(%，×400)

2.3 EE對VaD大鼠海馬炎性因子的影響 28d的環(huán)境干預(yù)后，3組大鼠海馬區(qū)炎癥因子IL-1β的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組IL-1β mRNA含量高于其他組(P<0.05)，模型+EE組的炎癥因子的含量比假手術(shù)組高(P<0.05)。見表3。

2.4 EE對VaD大鼠海馬區(qū)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響 免疫熒光的結(jié)果顯示，28d的環(huán)境干預(yù)后，模型組GFAP水平明顯高于其他2組(P<0.05)。而假手術(shù)組與模型+EE組之間的GFAP IOD/Area無明顯差異。模型組LCN2 IOD/Area最高，其次是模型+EE組，假手術(shù)組LCN2最低，且3組之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 干預(yù)28d后3組大鼠海馬區(qū)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的比較(%，×400)

表3 干預(yù)28d后3組大鼠海馬細(xì)胞凋亡、IL-1β、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白的比較

2.5 相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)系數(shù)(rs)顯示，環(huán)境干預(yù)28d后，大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間與炎癥因子IL-1β(rs=-0.859，P<0.05)和GFAP(rs = - 0.830，P<0.05)、LCN2(rs = -0.866，P<0.05)顯著負(fù)相關(guān)。見圖4。

3 討論

2-VO模型是大鼠慢性全腦缺血最常見的模型，學(xué)習(xí)和記憶的缺陷明顯，可較好模擬人類VaD的慢性腦低灌注病理生理過程。因此，2-VO模型廣泛用于VaD的研究[14,22]。本研究中2-VO大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)明顯不如假手術(shù)組，TUNEL染色的陽性細(xì)胞比例及海馬中GFAP的相對量均顯著高于正常水平，這與先前的研究一致[14,22]，顯示復(fù)制的2-VO大鼠模型是和血管性癡呆病理特征相符的。由于2-VO大鼠視力可能受損，故本研究對游泳速度進(jìn)行分析，排除了2-VO模型視力障礙對認(rèn)知表現(xiàn)的影響，認(rèn)為EE減輕了2-VO大鼠的認(rèn)知障礙。

圖4a～c 干預(yù)28d后大鼠認(rèn)知功能與海馬區(qū)IL-1β、GFAP和LCN2的相關(guān)性分析

既往研究表明，炎癥可能在腦缺血的慢性康復(fù)過程中導(dǎo)致認(rèn)知障礙[24]。炎癥因子會(huì)加劇炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元損傷[25]。其他研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β的增加顯著損害了海馬的空間記憶[26]。本研究中，VaD大鼠海馬炎癥因子IL-1β顯著增加，EE的介入下調(diào)了IL-1β的表達(dá)。在之前的研究中，EE還通過降低腦部炎癥因子的表達(dá)來減輕阿爾茨海默病大鼠的記憶喪失[9]。因此，本研究認(rèn)為EE能夠通過下調(diào)炎癥因子，降低海馬神經(jīng)炎癥。抗炎作用可能是EE減輕認(rèn)知障礙的潛在機(jī)制。

星形膠質(zhì)細(xì)胞在VaD海馬神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用。先前的研究證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞維持大腦的正常生理功能[27]。星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖被認(rèn)為與腦缺血后功能恢復(fù)有關(guān)。相反，先前也有研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞參與調(diào)節(jié)VaD的病理生理過程[28]。本研究顯示2-VO術(shù)后應(yīng)激形成的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)分泌IL-1β，上調(diào)海馬神經(jīng)炎癥，并認(rèn)為EE下調(diào)了VaD大鼠海馬區(qū)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。Rodriguez-Arellano等[28]也發(fā)現(xiàn)，環(huán)境刺激可調(diào)節(jié)阿爾茨海默病中的星形膠質(zhì)細(xì)胞。不同的研究證實(shí)了星形膠質(zhì)細(xì)胞在VaD中的積極作用和消極作用，一種可能的解釋是，大腦中存在兩種扮演不同角色的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞[27]。

A1反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌LCN2和炎性因子(包括IL-1β和NO等)，發(fā)揮消極作用；A2反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮積極作用，負(fù)責(zé)產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子[27]。研究表明A1反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞與認(rèn)知表現(xiàn)下降有關(guān)[30]。因此，本研究認(rèn)為EE通過下調(diào)海馬區(qū)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，減少IL-1β，發(fā)揮抗炎作用。

研究表明，LCN2可通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥因子(IL-1β)放大神經(jīng)炎癥，進(jìn)一步破壞海馬，可能導(dǎo)致VaD患者的認(rèn)知缺陷[21]。雖然本研究發(fā)現(xiàn)EE可以抑制VaD大鼠海馬區(qū)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度表達(dá)，但尚不能明確上述反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的類型，以及EE對A1和A2反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響是否不同。將腦損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞定向誘導(dǎo)為A2反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和開發(fā)抗海馬神經(jīng)炎癥的藥物可成為VaD認(rèn)知障礙治療的新方向。由于實(shí)驗(yàn)室條件有限，本研究并未使用激光多普勒血流儀檢測模型大鼠腦血流量的變化，后期的研究應(yīng)該使用這種更為直觀的方式檢測模型的成功與否。另外，本研究缺乏模型+抗炎藥物組，無法探究神經(jīng)炎癥在認(rèn)知障礙中的作用，課題組后續(xù)的的研究應(yīng)該增加這樣一個(gè)對照組。綜上所述，本研究表明EE下調(diào)VaD大鼠海馬神經(jīng)炎癥和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，并促進(jìn)認(rèn)知功能的恢復(fù)。