張少芬，王志蓮

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，近年研究表明，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是多基因的遺傳學(xué)與表觀遺傳學(xué)共同作用的結(jié)果?，F(xiàn)在越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤中表觀遺傳學(xué)的改變，特別是基因的異常甲基化在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中扮演不可或缺的角色，對其進行研究有利于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)及在治療上取得新突破。其中抑癌基因啟動子區(qū)CpG 島的異常高甲基化可以引起腫瘤抑制基因沉默表達，與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)[1]。人類DKK3（dickkopf-3）是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，也是經(jīng)典Wnt 信號傳導(dǎo)通路的重要的細胞外抑制因子。DKK3 在人類惡性腫瘤中普遍下調(diào)，是致癌過程中潛在的關(guān)鍵因素。現(xiàn)對DKK3基因的分子生物學(xué)特性、在腫瘤中的表達和功能及其與宮頸癌相關(guān)性的研究進展進行綜述。

1 DKK3 概述

DKK3 基因?qū)儆诰幋a分泌性Wnt 拮抗劑的Dickkopf 基因家族（包括DKK1、DKK2、DKK3、DKK4及Soggy），也被命名為“永生化細胞中的減少表達基因”（reduced expression in immortalized cells gene，REIC）。該基因位于人類染色體的11p15.3 位點，這是一個在癌變中常缺失的位點。DKK3 基因包含46 358 個核苷酸，有9 個外顯子和2 個啟動子，mRNA第198～1 247 堿基對編碼產(chǎn)生由350 個氨基酸組成的DKK3 蛋白[2]。

DKK3 是一種分泌糖蛋白，分子質(zhì)量約為38 ku，是DKK 蛋白家族中的一個特征性成員。DKK3 含有2 個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域Cys-1 和Cys-2，其中氨基端富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域是每個DKK 蛋白特有的，而羧基端半胱氨酸豐富的結(jié)構(gòu)域在家族成員中是保守的，暗示一個保守的功能，這2 個結(jié)構(gòu)域由12 個氨基酸組成的連接區(qū)隔開。DKK3 與其他家族成員同樣具有幾個蛋白酶水解位點，表明其在翻譯后發(fā)生了修飾。但與DKK1 和DKK2 只有1 個潛在的N-糖基化位點不同，DKK3 具有4 個潛在的N-糖基化位點，且存在特殊結(jié)構(gòu)Soggy（SGY）結(jié)構(gòu)域[3]。

2 DKK3 與腫瘤的關(guān)系

2.1 DKK3 的抑癌機制DKK3 屬于Dickkopf Wnt信號通路抑制因子家族，該家族成員通過與細胞表面受體或細胞質(zhì)中伴侶蛋白相互作用而發(fā)揮Wnt 信號通路內(nèi)源性拮抗劑的功能。Wnt 信號是一種進化保守的信號通路，在形態(tài)發(fā)生和癌變過程中起著重要作用，該信號通路的異常激活在多種惡性腫瘤的發(fā)病機制中起著核心作用[4]。DKK3 與DKK1、DKK2和DKK4 不同，不與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（lowdensity lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）或受體Kremen1 結(jié)合[5]，其調(diào)控Wnt/β-catenin信號的能力存在爭議，可能是通過一種與Wnt 無關(guān)的途徑參與β-catenin 失活，從而抑制β-catenin 下游的靶基因（例如c-myc、Cyclin D、Axin-2 等）表達。Leonard 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，除DKK3 蛋白外，DKK3 基因還編碼一種細胞質(zhì)的、非分泌型的異構(gòu)體DKK3b，DKK3b 填補了連接DKK3 基因與其調(diào)節(jié)β-catenin信號通路間的空白。

除了β-catenin 信號通路，DKK3 還可通過其他途徑發(fā)揮抗腫瘤功能。DKK3 可通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)JNK 激活，促進細胞型特異性caspase 依賴型凋亡[7]。還有文獻報道，在卵巢癌細胞中DKK3可通過逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。DKK3 還可能通過抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲[9]。此外，目前認為DKK3 可能是一種新的免疫調(diào)節(jié)劑，激活了抗腫瘤免疫反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)在外周血單核細胞中，DKK3 蛋白上調(diào)了單核細胞向樹突狀細胞樣表型的分化，并隨后激活了細胞毒性T 淋巴細胞的功能[10-11]。

2.2 DKK3 重要的失活機制DKK3 啟動子區(qū)富含CpG 島，已有研究證實在DKK3 啟動子區(qū)域的異常甲基化狀態(tài)是導(dǎo)致DKK3 表達下調(diào)、沉默的原因之一[12]。癌組織中DKK3 基因啟動子區(qū)CpG 島甲基化水平高于正常組織，這種高甲基化狀態(tài)在多種惡性腫瘤（如非小細胞肺癌、結(jié)腸癌、肝癌）中均被檢測到[13]，且DKK3 基因甲基化水平及表達情況與疾病嚴重程度、預(yù)后好壞有關(guān)。鑒于DKK3 基因異常甲基化在多種腫瘤中均可檢測到，其可作為判斷患者發(fā)病、復(fù)發(fā)、預(yù)后的生物標(biāo)志物，較傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物具有更高的敏感度及特異度，在疾病的診斷、監(jiān)測等方面具有重要價值。

2.3 DKK3 是腫瘤治療中的潛在靶點基因啟動子甲基化的潛在可逆性為新型抗癌藥物的開發(fā)提供了機會。有研究發(fā)現(xiàn)，去甲基化治療可以恢復(fù)DKK3在胃癌細胞中的功能，即促進癌細胞凋亡并抑制其增殖[14]。近年來，隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，一些DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）抑制劑（如5-氮胞嘧啶、地西他濱等）得以開發(fā)，這些藥物可重新激活表觀沉默的腫瘤抑制基因，并被成功地用于治療包括口腔鱗狀細胞癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤[15]。

此外，DKK3 靶向性腫瘤治療，即腫瘤內(nèi)注射攜帶REIC/DKK3 基因的腺病毒載體（adenoviral vector，Ad）也是一種前景廣闊的基因治療方法。該方法通過啟動DKK3 基因在惡性組織中的重新表達來誘導(dǎo)癌細胞凋亡。據(jù)報道，第2 代腺病毒介導(dǎo)的DKK3 全長cDNA 在小鼠異種移植瘤模型中的表達能發(fā)揮抗腫瘤作用[16]?，F(xiàn)在，有研究正在探討Ad-REIC 在肝癌[17]等惡性腫瘤治療中的臨床應(yīng)用。總之，DKK3 可能是一個潛在的抗癌靶點，但尚需進一步研究來驗證基因治療的可行性。

3 DKK3 與宮頸癌的相關(guān)性

宮頸癌是威脅全球婦女健康及生命的主要惡性腫瘤之一，目前其發(fā)病率為女性惡性腫瘤的第4 位，也是婦女惡性腫瘤死亡的第4 大原因[18]。眾所周知，高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要病因，基于此，HPV 疫苗的應(yīng)用和宮頸癌篩查使宮頸癌的發(fā)病率顯著降低。但宮頸癌發(fā)病率和死亡率在發(fā)展中國家仍居高不下，其依然是一項全球性的重大健康挑戰(zhàn)[19]。據(jù)估計，2018年我國有10.6萬新發(fā)病例和4.8 萬例死亡[20]。目前關(guān)于宮頸癌的研究已廣泛開展，但其具體發(fā)病機制及協(xié)同因素仍有待闡明。

隨著對宮頸癌表觀遺傳學(xué)機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)原癌基因、抑癌基因及相關(guān)調(diào)節(jié)基因的分子生物學(xué)異常改變與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。不同的研究報道了宮頸癌患者中經(jīng)常發(fā)生改變的不同組基因，而DKK3 是其中具有代表性的抑癌基因之一。2009年，Lee 等[21]首次發(fā)現(xiàn)，與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中DKK3 mRNA 表達常下調(diào)，并與其啟動子區(qū)高甲基化有關(guān)，這一結(jié)果與DKK3 在多數(shù)腫瘤中的表現(xiàn)一致。研究表明，Wnt/β-catenin 信號通路在人子宮頸角質(zhì)形成細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中被激活，β-catenin 結(jié)構(gòu)和信號特性的不平衡參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，最終宮頸癌組織中β-catenin 在細胞質(zhì)和（或）細胞核中異常積累。宮頸癌中DKK3 蛋白作為β-catenin 的負調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，其下調(diào)參與了β-catenin 信號通路的激活。一方面DKK3 蛋白抑制β-catenin 的轉(zhuǎn)錄活性，降低β-catenin 表達，并阻斷β-catenin 向細胞核的轉(zhuǎn)運使其失活；另一方面通過與含有β 轉(zhuǎn)導(dǎo)素的重復(fù)蛋白（βTrCP）的協(xié)同作用增強DKK3 蛋白對β-catenin 的抑制作用，促進βcatenin 降解（或）核轉(zhuǎn)運，最終導(dǎo)致β-catenin 下游靶基因（VEGF、Cyclin D）表達減少[21]。之后，Ryu 等[22]通過免疫組織化學(xué)法證實在50%的宮頸原位癌及64.8%的浸潤癌中DKK3 蛋白的表達低于正常對照組。Luo 等[23]的研究表明，DKK3 是HeLa 細胞中miR-92a 的直接靶基因，其蛋白表達受miR-92a 的負調(diào)控，DKK3 的過表達減弱了miR-92a 對宮頸癌細胞活力和侵襲的促進作用。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機制復(fù)雜，是一個多因素、多基因、多步驟協(xié)同參與的過程，DKK3 參與的詳細機制尚未完全清楚。

DKK3 可作為治療宮頸癌的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)將DKK3 導(dǎo)入HeLa 宮頸癌細胞后，抑制β-catenin表達，同時細胞集落形成減少，細胞生長減慢，這提示DKK3 蛋白對宮頸癌細胞具有抗增殖活性[21]。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)DKK3 過度表達促進宮頸癌HeLa 細胞中Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，抑制B 細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）在細胞中的表達，最終抑制HeLa 細胞的增殖、遷移和侵襲，促進癌細胞凋亡[24]。

目前一些研究對宮頸癌患者中DKK3 表達水平與預(yù)后相關(guān)性進行了分析。宮頸組織中DKK3 蛋白高表達的患者總體生存率和腫瘤緩解率均較高，DKK3 蛋白低表達則與宮頸癌患者的不良臨床結(jié)局有關(guān)[22]。Jiang 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血清DKK3蛋白水平明顯高于正常人，且與臨床分期、腫瘤直徑有關(guān)，表明血清DKK3 蛋白水平低對患者預(yù)后不良有較好的預(yù)測作用。在基因甲基化方面，van der Meide等[26]研究表明癌組織中DKK3 啟動子甲基化頻率顯著高于正常宮頸組織，且與宮頸鱗狀細胞癌相比，宮頸腺癌中DKK3 甲基化頻率明顯升高。2018年，Zhang等[27]進一步發(fā)現(xiàn)38%的宮頸腺癌組織中有DKK3 啟動子甲基化，而在正常宮頸組織未發(fā)現(xiàn)。DKK3 基因的甲基化水平隨腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移而升高，與宮頸腺癌的預(yù)后密切相關(guān)，可用于宮頸腺癌患者預(yù)后和治療效果的評估[4]。Kang 等[28]則證實了DKK3 甲基化對預(yù)后不利，并首次通過比較定量的甲基化分析確定了與宮頸鱗狀細胞癌患者無復(fù)發(fā)生存相關(guān)的DKK3 啟動子區(qū)域第1 位甲基化水平的閾值（26.3%），進一步確定了預(yù)測疾病復(fù)發(fā)的新的臨床-表觀遺傳組合，旨在對宮頸癌患者進行更精確地分層，優(yōu)化治療方案。

總之，DKK3 基因啟動子甲基化是宮頸癌中的頻發(fā)事件，這為宮頸癌發(fā)病機制的研究提供了新的思路，也為宮頸癌的治療提供了新的方向。DKK3 可能作為宮頸癌新的治療靶點，并在宮頸癌的分期預(yù)測、預(yù)后評估中可能有所作用。

4 結(jié)語與展望

宮頸癌的發(fā)生是體內(nèi)外等多方面因素共同作用的結(jié)果。盡管目前的研究已經(jīng)證實DKK3 參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但對其作為抑癌基因在宮頸癌分子發(fā)病機制中的作用仍知之甚少，其與其他癌基因及抑癌基因之間的相互作用機制尚需進一步探索。隨著對DKK3 基因的進一步深入研究，其可能會成為宮頸癌診斷、治療及其預(yù)后的指標(biāo)，并為闡明宮頸癌的發(fā)生機制及行基因治療提供新思路。