鄭榮兒,吳佳敏,張瑞娟,姬金亮,李雅彬,俞曉平,許益鵬

(中國計量大學 生命科學學院 浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室,浙江 杭州 310018)

褐飛虱Nilaparvatalugens(St?l)(Hemiptera: Delphacidae),是一種在我國和東南亞地區(qū)的農(nóng)業(yè)害蟲之一,以水稻韌皮部為食,爆發(fā)時會對水稻造成巨大的危害,在農(nóng)業(yè)上防治較為困難[1]。目前,基于基因功能的研究,利用RNA干擾等分子生物學技術防治褐飛虱已經(jīng)成為一種新興的防治方法[2]。PIGM,編碼糖基磷脂酰肌醇(GPI)甘露糖基轉移酶I,在GPI錨蛋白的生物合成途徑中負責將第一個甘露糖從多利醇-磷酸-甘露糖轉移到內(nèi)質網(wǎng)網(wǎng)腔側的前體上,對于GPI錨蛋白的合成具有至關重要的作用[3]。PIGM亞純啟動子的突變將阻斷GPI的轉錄,從而導致遺傳性糖基磷脂酰肌醇的缺乏,引起靜脈血栓的形成和癲癇的發(fā)作[4]。目前,關于PIGM的研究都集中在哺乳動物或原生動物中,在昆蟲中未見相關的報道。我們前期發(fā)現(xiàn),褐飛虱PIGM(NlPIGM)在卵巢中特異性高表達,并通過功能研究證明NlPIGM在褐飛虱的生殖發(fā)育中具有重要的調控作用,RNA干擾NlPIGM的表達會導致褐飛虱雌成蟲卵巢發(fā)育延滯、產(chǎn)卵量下降、胚胎發(fā)育畸形,但其具體的作用機制不明。因此,進一步研究PIGM在褐飛虱中的作用機制對于利用PIGM作為褐飛虱防治靶標有著重要意義。

酵母雙雜交是一種在篩選潛在互作蛋白和研究蛋白之間相互作用方面被廣泛應用的生物技術。Chi等[5]構建了煙粉虱Bemisiatabaci的cDNA文庫并從中篩選了54個可能與棉花曲葉病毒外殼蛋白相互作用的候選蛋白;Yu等[6]通過酵母雙雜交證明家蠶BombyxmoriSpz2通過與Toll 11和Toll 9-1相互作用而誘導抗菌肽的表達;Du等[7]通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)中紅側溝繭蜂Microplitismediator中的GAP1蛋白能夠與棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的RhoA和Cdc42相互作用以抑制宿主的免疫反應,從而提高寄生成功的可能性;Guo等[8]構建了真菌感染后的小麥cDNA文庫,篩選和驗證了小麥熱休克蛋白Hsp70與HSF A9L和Hsp90-4存在相互作用,為闡明小麥HSP對真菌感染的反應機制提供了依據(jù)。酵母雙雜交技術也已廣泛成為研究稻飛虱在植物-宿主互作和病毒-宿主互作等方面的一種技術[9-11]。如Huang等[10]通過酵母雙雜交系統(tǒng)構建的cDNA文庫鑒定了一個與褐飛虱寡霉素敏感相關蛋白相互作用的水稻齒葉矮縮病毒非結構蛋白Pns10;Qin等[12]則通過酵母雙雜交實驗確定了灰飛虱中腸上皮糖轉運蛋白6(ST6)與水稻條紋病毒核衣殼蛋白的相互作用,確定了ST6是水稻條紋病毒跨越中腸感染屏障的關鍵因子。

本研究通過構建褐飛虱cDNA文庫和誘餌載體pGBKT7-NlPIGM,利用酵母雙雜交系統(tǒng)從褐飛虱cDNA文庫中篩選與NlPIGM具有潛在相互作用的蛋白,以進一步探究NlPIGM的作用機制。

1 主要材料與方法

1.1 主要材料

供試褐飛虱長期飼養(yǎng)于中國計量大學溫網(wǎng)室與人工氣候室中,飼養(yǎng)溫度27 ℃±1 ℃,相對濕度為60%,光周期L∶D=16 h∶8 h,飼養(yǎng)所用水稻品種為TaichungNative1(TN1)。

主要試劑:RNA提取試劑盒(TaKaRa,AK1703)、反轉錄試劑盒(TaKaRa,AK71648A)、DNA割膠回收試劑盒(TaKaRa,AI51866A)、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ(TaKaRa,AJE1364A)和SalⅠ(TaKaRa,AJ11106A)、T4連接酶(TaKaRa,AI60350A),質粒小量提取試劑盒(上海生工生物工程,BB12KA1530)、Trizol(Invitrogen,14105),Oligotex mRNA Midi Kit(Qiagen),JM109大腸桿菌感受態(tài)(TaKaRa,AK51792A)、pMD19T(TaKaRa,K4001AA)、pGBKT7和pGADT7載體以及Y2H Gold酵母菌株保存于本實驗室。

主要儀器:金屬浴鍋(K30,杭州奧盛儀器有限公司)、超凈工作臺(SW-CJ-ZP,浙江蘇凈凈化設備有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(HPX-9272-MBE,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、搖床(ULT2186-4-V49)、PCR儀(T100,Bio-Rad)、凝膠成像儀等(Universal Hood Ⅱ,Bio-Rad)。

1.2 主要方法

1.2.1 褐飛虱總RNA的提取及mRNA的純化

取發(fā)育至3～5日齡的褐飛虱雌成蟲,用0.5 mmol/L的PBS沖洗數(shù)次后轉移至預冷的研缽中,液氮研磨后轉移至無RNase的離心管中,使用Trizol法提取褐飛虱的總RNA。隨后,使用Oligotex mRNA Midi Kit對mRNA進行分離純化(分離步驟參照試劑盒使用說明書)。然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質量,并使用cDNA合成試劑盒將mRNA反轉錄成cDNA。

1.2.2 cDNA文庫的構建

褐飛虱cDNA初級文庫的構建通過CloneMiner cDNA文庫構建試劑盒進行。合成雙鏈cDNA后,將attB1連接到雙鏈cDNA末端,試劑和實驗方法如下:將10 μL 5× Adapter Buffer,4 μLattB1 Adapter,8 μL 0.1 M DTT,6 μL T4 DNA Ligase混勻,在16 ℃孵育16～24 h;70 ℃,10 h。然后使用柱層析法將cDNA產(chǎn)物分離、沉淀、清洗、溶解后,加入2 μL pDONR222質粒,通過BP重組反應鏈接載體。

電轉化大腸桿菌DH10B:在重組反應液中加入2 μL proteinase K,37 ℃ 15 min,75 ℃ 10 min。加入大腸桿菌DH10B后冰浴10 min,然后轉移到電擊杯中電轉化,轉化條件:1.5 kV,200 Ω,25 Mf。電轉化完成后加入4 mL SOC液體培養(yǎng)基,37 ℃,250 r/min搖床1 h,然后取10 μL菌液,稀釋100倍,取50 μL稀釋后的菌液涂布于Amp抗性的LB培養(yǎng)基上,37 ℃過夜培養(yǎng)后用于計算文庫滴度和庫容量。用LB液體培養(yǎng)基收集其余菌液涂平板所得的菌體,其余菌液涂布于Amp抗性的LB平板,過夜,用使用質粒小量抽提試劑盒抽提質粒,得到初級cDNA文庫。

次級cDNA文庫構建:將提取到的初級cDNA文庫質粒稀釋到300 ng/μL,加入1 μL pGADT7-DEST(300 ng/μL),4 μL LR Clonase,14 μL ddH2O,混勻,25 ℃,孵育16～20 h。然后電轉化于DH10B感受態(tài)細胞,涂布于Amp抗性的LB平板上,鑒定庫容和滴度,提取次級文庫cDNA質粒,保存。

次級cDNA文庫轉化Y187酵母菌株:簡單來說,就是將5 μL次級文庫cDNA質粒,20 μL ssDNA和600 μL Y187酵母感受態(tài)細胞混勻,然后使用PEG/LiAC轉化法將質粒轉化至Y187酵母感受態(tài)細胞,鑒定庫容和滴度,獲得褐飛虱cDNA文庫。

1.2.3 文庫質量和滴度的測定

將轉化完成的次級文庫菌液分別稀釋100倍,1 000倍和10 000倍,各取100 μL涂布于SD-Leu平板上,計算菌落生成數(shù)量。文庫滴度的計算方法如下:文庫滴度=單菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂布菌液體積(mL)。

原始庫容量(CFU)計算方法如下:CFU=文庫滴度×文庫體積(mL)。

將cDNA文庫質粒轉化至Y187酵母菌株后,取100 μL均勻涂布于Amp抗性的LB培養(yǎng)基上,隨機挑選24個平板上的單克隆,利用pGADT7通用引物(表1)對其進行PCR檢測,計算文庫重組率。重組率計算方法如下:重組率=(陽性插入片段的克隆數(shù)/反應總數(shù))×100%。

1.2.4 兩步法構建pGBKT7-NlPIGM重組誘餌載體

以設計的BD-NlPIGM-F/R引物(表1),褐飛虱的cDNA為模板,擴增NlPIGM,產(chǎn)物電泳鑒定后回收,與pMD19T進行16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉化到JM109大腸桿菌感受態(tài)細胞中,取200 μL菌液,涂布于Amp抗性的LB平板上,37 ℃過夜培養(yǎng)。次日挑取單個菌落,在含有Amp抗性LB培養(yǎng)基的離心管中培養(yǎng)(37 ℃,180 r/min),取菌液送上海生工生物工程有限公司測序。挑選轉化成功的轉化子,抽提質粒。將鑒定后的重組質粒命名為pMD19T-NlPIGM。然后將pMD19T-NlPIGM質粒和pGBKT7空載體分別使用NcoⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切,將割膠回收后的pMD19T-NlPIGM質粒的目的片段和pGBKT7質粒的載體片段用T4連接酶連接,轉化到大腸桿菌JM109感受態(tài)中,挑取轉化子搖床振蕩培養(yǎng)(37 ℃,180 r/min),用NcoⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定,測序,鑒定無誤的轉化子抽提質粒,命名為pGBKT7-NlPIGM,保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 用于本研究的引物序列

1.2.5 重組誘餌質粒轉化Y2H gold酵母菌株

通過PEG/LiAc轉化法,將pGBKT7空載體及pGBKT7-NlPIGM載體分別轉化到Y2H Gold酵母菌株中。先將Y2H Gold在YPDA固體培養(yǎng)基上劃線,于30 ℃培養(yǎng)2～3 d,取1.5 mL離心管,加入1 mL 0.1 mol/L LiAc,挑取單菌落于離心管中重懸,30 ℃,180 r/min振蕩搖床5 min,離心收集菌體。依次加入50% PEG-3350 240 μL,1 mol/L LiAc 36 μL,95 ℃金屬浴5 min,然后冰上放置1 min預處理的ssDNA 0.1 μg,質粒DNA 5 μL,ddH2O 20 μL,漩渦振蕩,42 ℃金屬浴20 min,離心,取上清,加入ddH2O 100 μL。取稀釋10倍,100倍的菌液分別涂布于SD-Trp培養(yǎng)基上,30 ℃封口倒置培養(yǎng)3～5 d,出現(xiàn)單菌落以后,劃線一次,然后進行菌落PCR驗證,成功轉化的菌株保存于-80 ℃冰箱。

1.2.6 誘餌重組質粒的自激活活性及其毒性鑒定

1)重組誘餌質粒的自激活活性鑒定:挑選成功轉化的重組誘餌菌接種到SD-Trp,SD-trp/X-α-gal,SD-trp/X-α-gal/AbA培養(yǎng)基中,37 ℃封口倒置培養(yǎng)1 d,觀察生長情況,pGBKT7空載體作為對照組。

2)重組誘餌質粒的毒性鑒定:將pGBKT7-NlPIGM重組載體轉化至大腸桿菌Y2H Gold感受態(tài)細胞,取稀釋10倍和100倍的菌液100 μL接種在SD-Trp培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng),觀察其生長情況。轉化pGBKT7空載體的菌株作為對照組。

1.2.7 酵母雙雜交篩選潛在互作蛋白

通過mating法篩選雙雜交文庫,將在SD-trp-Leu-His-Ade/X-α-gal/ABA平板上變藍的雜交克隆送測序,然后通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比對,并分析可能具有相互作用的蛋白功能。

2 結果與分析

2.1 褐飛虱總RNA提取及mRNA電泳驗證

從褐飛虱中提取總RNA,測定其RNA OD260/OD280為2.13,電泳檢測發(fā)現(xiàn)28S rRNA和18S rRNA條帶清晰,明亮,亮度比例接近2∶1(圖1A),說明提取的總RNA未發(fā)生降解,完整性較好。mRNA純化后經(jīng)電泳檢測發(fā)現(xiàn)條帶成彌散狀分布,質量較高(圖1B)。

注:A—提取的總RNA電泳;B—純化的mRNA電泳;M—DL 2000 Marker圖1 總RNA(A)和純化的mRNA(B)電泳圖Figure 1 Electrophoresis of total RNA(A) and purified mRNA(B)

2.2 cDNA文庫的質量和滴度鑒定

將合成的cDNA經(jīng)過BP重組獲得初級cDNA文庫,統(tǒng)計稀釋了100倍的SD-Leu平板上的菌落數(shù)量為1 300,通過文庫滴度計算公式得初級文庫滴度為2.6×107CFU/mL,初級文庫庫容量為1.04×108CFU。平板上挑選的隨機克隆經(jīng)PCR鑒定,發(fā)現(xiàn)插入片段范圍集中在750～2 000 bp,沒有發(fā)現(xiàn)空載體,計算重組率為100%(圖2A),說明初級cDNA文庫質量的完整性和覆蓋性較好。

將初級文庫質粒通過LR重組反應得到次級文庫,涂布于Amp抗性的平板上,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)稀釋了100倍的平板上克隆數(shù)目為1 700,通過公式計算得到次級文庫的滴度為3.4×107CFU/mL,次級文庫庫容量為1.36×108CFU,在平板上隨機挑選的24個克隆經(jīng)PCR鑒定后,發(fā)現(xiàn)插入片段范圍集中在750～2 000 bp,沒有發(fā)現(xiàn)空載體,計算重組率為100%(圖2B)。

另外將次級文庫轉化Y187酵母菌株,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)稀釋10 000倍的平板有600個克隆,計算文庫滴度為6.0×107CFU/mL。隨機挑取克隆,PCR檢測后,得到不同大小的條帶,且條帶大小集中于750～2 000 bp附近(圖2C),表明成功構建褐飛虱cDNA酵母文庫,且文庫的質量較好,可以用于酵母雙雜交實驗。

注:A—初級文庫PCR鑒定;B—次級文庫PCR鑒定;C—Y187酵母菌株PCR鑒定;M—DL 2000 Marker;1～24—隨機挑選的克隆圖2 cDNA文庫插入片段的電泳檢測圖Figure 2 Electrophoresis identification of inserts in the cDNA library

2.3 誘餌重組載體(pGBKT7-NlPIGM)的鑒定

為了準確測定那西肽預混劑中那西肽的含量，參考飼料中那西肽的檢測方法[11]，研究了高效液相色譜-熒光檢測法測定那西肽預混劑含量的方法，方法操作簡便，靈敏度高，對建立的方法與抗生素微生物檢定法進行比較，以期為獸藥質量標準提供新的選擇。

將NlPIGM與pGBKT7載體連接,然后用NcoⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶對pGBKT7-NlPIGM載體進行雙酶切鑒定,鑒定結果顯示產(chǎn)物雙酶切后條帶大小與預期一致(圖3),且測序結果顯示序列正確,表明成功構建了pGBKT7-NlPIGM重組載體。

此外,將誘餌重組載體pGBKT7-NlPIGM轉化至Y2H Gold酵母菌株中,涂布,然后通過菌液PCR擴增NlPIGM鑒定載體轉化情況。結果發(fā)現(xiàn)菌液PCR條帶明亮、大小與預期一致(圖4),說明成功構建了pGBKT7-NlPIGM誘餌重組載體的Y2H Gold菌株。

注:M1—DL 2000 Marker;M2—DL 10000 Marker;1～2—用于酶切的2個重組載體圖3 重組誘餌載體雙酶切驗證圖Figure 3 Verification of recombinant bait vector digested with double restriction enzymes

注:M—DL 2000 Marker;1～5—隨機挑選的5個克隆圖4 Y2H Gold菌株菌落PCR電泳鑒定圖Figure 4 Colony PCR electrophoresis identification of Y2H Gold strain

2.4 誘餌重組載體的自激活和毒性檢測

將轉化了pGBKT7空載體的菌株接種到SD-trp培養(yǎng)基上,將pGBKT7-NlPIGM誘餌重組載體的菌株接種到SD-Trp,SD-trp/X-α-gal,SD-trp/X-α-gal/AbA培養(yǎng)基上。結果發(fā)現(xiàn)轉化了pGBKT7空載體的菌株生長狀況良好,轉化了pGBKT7-NlPIGM載體的Y2H Gold菌株在SD-Trp和SD-Trp-X-α-gal的培養(yǎng)基中能生長,克隆顏色為白色,生長速度和克隆大小與對照組無明顯區(qū)別,在SD-trp/X-α-gal/AbA培養(yǎng)基中不生長(圖5);另外,轉化菌液培養(yǎng)24 h后測定OD600均大于0.8,說明pGBKT7-NlPIGM誘餌重組載體對酵母菌株無毒性和自激活活性,可以用于后續(xù)的酵母雙雜交實驗。

2.5 酵母雙雜交陽性克隆鑒定

利用mating法篩選cDNA文庫,將SD-trp-Leu-His-Ade/X-α-gal/ABA平板上變藍的陽性克隆送測序,然后與NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blastn比對,結果顯示陽性克隆與數(shù)據(jù)庫序列高度同源(表2)。

注:A—pGBKT7空載體轉化Y2H Gold的酵母菌株,SD-Trp培養(yǎng)基;B—pGBKT7-NlPIGM重組載體轉化Y2H Gold的酵母菌株,SD-Trp培養(yǎng)基;C—pGBKT7-NlPIGM重組載體轉化Y2H Gold的酵母菌株,SD-Trp-X-α-gal培養(yǎng)基圖5 重組誘餌載體自激活和毒性檢測Figure 5 Self-activating activity and toxicity of recombinant bait vector identification

表2 陽性克隆測序結果比對分析

3 討 論

高質量的cDNA文庫和誘餌重組載體的構建是成功實現(xiàn)酵母雙雜交技術的重要前提。薛進等構建了白背飛虱的酵母雙雜交cDNA文庫,結果顯示初級文庫的庫容量為1.72×107CFU,滴度為1.72×106CFU/mL,Y187酵母菌株文庫滴度為5.09×107CFU[13]。肖東來等人構建了灰飛虱酵母雙雜交cDNA文庫,檢測表明初級文庫的庫容量為1.85×107CFU,擴增文庫的總庫容為1.5×109CFU,文庫滴度為7.7×108CFU/mL[14]。在本研究中,我們所提取的褐飛虱RNA及純化的mRNA質量較高,且大部分都分布在100～2 000 bp之間,達到了文庫構建的要求。通過對構建的文庫進行分析,結果表明構建的初始cDNA文庫庫容量為1.04×108CFU,高于薛進和肖東來等人構建的文庫庫容,遠大于1×107CFU的庫容量需求;次級文庫庫容為1.36×108CFU,次級文庫滴度為3.4×107CFU/mL,雖然小于肖東來等人構建的文庫滴度,但仍大于3×107CFU/mL的滴度需求。PCR結果顯示文庫cDNA集中在500～2 000 bp附近,從而保證了文庫具有較廣的覆蓋度及較好的多樣性和轉化效果。另外,我們在雙鏈cDNA的末端加上3個不同的接頭,保證了插入的cDNA序列的方向和完整性,提高了cDNA文庫的質量和篩選的完整性。

總的來說,本研究通過構建高質量的褐飛虱cDNA文庫和pGBKT7-NlPIGM重組載體,篩選到了一些與PIGM具有相互作用的蛋白,為探究NlPIGM的作用機制提供了基礎,但下一步還需要通過RNAi、免疫共定位、免疫共沉淀等手段來進一步確認NlPIGM與這些蛋白的相互作用。