李 特

（眉縣食品安全檢驗檢測中心，陜西寶雞 722300）

銅綠假單胞菌原稱綠膿桿菌，在自然界分布十分廣泛，其喜好較濕潤的環(huán)境，為土壤中存在的最常見的細菌之一。水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。銅綠假單胞菌為條件致病菌，一般條件下不會感染人，但如果人的防御機制被破壞，抵抗力降低，如皮膚黏膜破損、使用激素或抗生素的患者等易被感染。因此，銅綠假單胞菌超標對抵抗力較弱的人群存在較大的感染風險，如抵抗力差的老人和小孩，易引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病。

1 .材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 菌株和樣品

檢驗及計數(shù)過程中以銅綠假單胞菌標準菌株（ATCC 27853）作為陽性對照菌株，以熒光假單胞菌標準菌株（ATCC 13525）作為陰性對照菌株。質(zhì)控樣凍干粉安瓿瓶1瓶。

1.1.2 儀器設備

智能恒溫恒濕箱HWS-150A（杭州大材光電科技有限公司）；多聯(lián)過濾系統(tǒng)MFS-6A-250-K（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；凈化工作臺SW-CJ-1FD（蘇州同盛）；生物安全柜BSC-1300IIA2（蘇凈安泰）；高壓蒸汽滅菌器MLS-3751L-PC（日本松下）；立式壓力蒸汽滅菌器LDZM-80KCS-Ⅱ（上海申安醫(yī)療器械廠）；紫外檢測燈BD-AA 366 nm（北京啟航博達科技有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑

假單胞菌瓊脂基礎培養(yǎng)基（CN平板）、營養(yǎng)瓊脂、綠膿菌素測定培養(yǎng)基、金氏B培養(yǎng)基、乙酰胺肉湯，以上培養(yǎng)基均由北京陸橋股份有限公司生產(chǎn)；氧化酶試紙（廣東環(huán)凱）；無菌水及0.85%生理鹽水為實驗室自備。

1.1.4 實驗物品

一次性使用濾杯；一次性使用培養(yǎng)皿；直徑47 mm，微孔徑為0.45 μm的無菌濾膜；100 mL三角瓶；鑷子；移液管。

1.2 方法

按照質(zhì)控樣說明書對凍干粉進行水化，然后10倍遞增稀釋，依據(jù)《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）采用濾膜法檢驗[1]。

1.2.1 樣品溶解

用75%酒精棉擦拭西林瓶外表面，開啟西林瓶，立即（1 min內(nèi)）加入少量（2～4 mL）稀釋液（0.85%生理鹽水）進行再水化，待溶解后，將其置于無菌三角瓶中，反復用余下的稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液于上述無菌三角瓶中，稀釋液總計40 mL。用移液管取10 mL加入到240 mL無菌生理鹽水中，該溶液即是待測樣品原液（即100）[2]。

1.2.2 樣品稀釋

分別取25 mL上述制備的待測樣品原液加入到225 mL無菌生理鹽水中（也可取50 mL上述制備的待測原液加到450 mL無菌生理鹽水中），制成1∶10樣品勻液，以此類推制備10倍系列稀釋樣品勻液，在100～1056個稀釋度按照標準方法進行后續(xù)操作（要求做平行樣）。

1.2.3 樣品過濾

過濾前，提前啟動超凈工作臺風機，用火焰噴槍對濾芯進行滅菌，待冷卻后，先用無菌鑷子夾取無菌濾膜邊緣部分將格柵面向上貼放在已滅菌的濾芯上，固定好濾杯，倒入250 mL樣液，啟動真空泵抽濾至凈干，待管里無水流動時，關閉真空泵，取下濾杯，將過濾后的濾膜貼在已制備好的CN瓊脂平板上，平鋪，格柵面向上，濾膜和CN平板之間不能有氣泡，如有氣泡可用鑷子夾著濾膜邊緣將濾膜提起排凈氣泡[3-4]。

1.2.4 培養(yǎng)

將CN平板放入36 ℃培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)24～48 h。在培養(yǎng)20～24 h和40～48 h后分別觀察濾膜上菌落的生長情況并計數(shù)。

2 結果報告

培養(yǎng)40 h左右CN平板上有4種菌落形態(tài)，分別為藍色菌落、紅褐色菌落、366 nm紫外燈下產(chǎn)熒光（非藍/綠色菌落）菌落及黃色菌落。按照GB 8538—2016中57.5.4步驟對前3種可疑菌落分別進行確證性實驗。驗證結果為藍色菌落綠膿菌素實驗陽性，紅褐色菌落氧化酶、產(chǎn)氨及產(chǎn)熒光實驗均為陽性，產(chǎn)熒光（非藍/綠色菌落）菌落產(chǎn)氨實驗陰性。根據(jù)藍色菌落的計數(shù)和確證性實驗的結果，計算每250 mL水樣中的銅綠假單胞菌數(shù)量。結果8.0×103CFU/250 mL，Z值為0.44，結果滿意。

3 結論

本次盲樣考核結果為滿意?？己饲皬娜?、機、料、法、環(huán)5個方面做好充足的準備。檢驗人員要熟悉標準、作業(yè)指導書及操作過程，思路清晰、實驗方案明確、實驗嚴瑾。通過此次考核也證明了實驗室滿足銅綠假單胞菌的檢測能力。

4 注意事項

①實驗前準備。實驗前準備好實驗所需物品，如濾杯、濾膜、鑷子、移液管、三角瓶和鹽水等，準備足夠的CN平板，確保實驗所需的培養(yǎng)基、試劑充分且在有效期內(nèi)。認真研讀理解作業(yè)指導書，提前想好實驗方案。②微生物質(zhì)控樣應放在-18 ℃冰箱中保存。使用時，從冰箱中取出待樣品達到室溫方可開啟使用。③移取操作準確。西林瓶中的液體可用一次性使用無菌注射器吸入三角瓶中，避免樣液損失。④放進培養(yǎng)箱后再次確認培養(yǎng)溫度是否符合標準要求，培養(yǎng)24 h后即可先觀察計數(shù)，避免有的細菌生長過快、過大覆蓋其他細菌影響計數(shù)，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h左右再次計數(shù)，綜合2次的計數(shù)確定最終的可疑菌落數(shù)。⑤實驗結束后所有與實驗相關的物品均需按實驗廢棄物處理方法121 ℃高壓滅菌至少30 min后，裝入特殊標志的垃圾袋內(nèi)，送到指定地點[5]。