楊夢瑤 ，吳雨晴 ，劉辰辰 ，郭 宇，劉俊偉

(1. 天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院 天津 300457；2. 南開大學(xué)藥學(xué)院 天津 300350)

有研究表明快速生長的組織一般都有活性的多胺合成體系，尤其是腫瘤的快速生長亦有賴于多胺含量的顯著增長[1]。作為精胺的二乙?；苌?，N1,N12-二乙酰精胺(N1,N12-diacetylspermine，DiAcSpm)對于非小細胞肺癌患者，尤其是Ia臨床階段患者的靈敏度比其他腫瘤標(biāo)志物都要高[2]，并且尿液中的DiAcSpm可作為生存率的獨立預(yù)后因素[3-4]。圖1為N1,N12-二乙酰精胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。在不同臨床階段，DiAcSpm對結(jié)腸癌檢測的靈敏度也高于CEA和CA19-9[5]。同時，因為不同個體之間N1,N12-二乙酰精胺的尿液含量差別較小，所以通過DiAcSpm含量變化來檢測癌癥的發(fā)生相對于總多胺或其他多胺類化合物而言準確率較高[6-8]。

但是由于DiAcSpm缺乏伯氨基，再加上其在尿液中的含量低于0.5%，以常規(guī)的儀器分析手段無法滿足檢測需求，需用GC-MS、HPLC-MS以及MSICE-MS/MS[9-10]等高靈敏度檢測儀器。這些儀器檢測用時長、價格昂貴，無法滿足臨床上的日常檢測[11]。本研究以N1-乙酰精胺為半抗原，通過與載體蛋白偶聯(lián)制備出N1,N12-二乙酰精胺人工抗原，通過免疫動物獲得抗DiAcSpm特異性抗體，結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫分析法建立了可用于人體尿液樣本中N1,N12-二乙酰精胺的快速檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

N1-乙酰精胺(美國Cayman Chemical公司)；N1,N12-二乙酰精胺(美國Quality Control Chemicals公司)；戊二醛(50%)、牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、脫脂奶粉、Triton X-100、吐溫-20(上海生工生物工程有限公司)；明膠(蘇州亞科科技股份有限公司)；魚皮膠(德國Sigma-Aldrich 公司)；弗氏佐劑(德國Sigma-Aldrich 公司)；化學(xué)發(fā)光底物(湖州英創(chuàng)生物科技公司)；HRP-山羊抗兔IgG(英國Abcam公司)；BS3(美國Thermo Fisher Scientific公司)；大耳白兔(天津科奧公司)；Protein A親和層析柱(美國GE公司)；其他試劑均為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人工抗原與抗體的制備

以BS3為交聯(lián)劑，將半抗原N1-乙酰精胺與載體蛋白偶聯(lián)，制備二乙酰精胺人工抗原。通過免疫日本大耳白兔，獲得抗DiAcSpm血清。采用親和層析法純化得到抗DiAcSpm抗體，具體方法見參考文獻[12]。

1.2.2 化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測步驟

將包被原100μL/孔固定在96孔板中，37℃孵育2h后洗板。每孔加入200μL封閉1h后洗板。

每孔分別加入50μL標(biāo)準品(或待測樣品)以及抗DiAcSpm抗體后37℃孵育，洗板后加入HRP-山羊抗兔IgG 100μL/孔，37℃孵育30min后洗板。加入化學(xué)發(fā)光底物后立即用化學(xué)發(fā)光儀測定每孔的相對發(fā)光強度(Relative light units，RLU)，并根據(jù)RUL計算抑制率，進而繪制標(biāo)準曲線或計算待測樣含量。

1.2.3 實驗條件的優(yōu)化

通過單因素實驗，本研究考察了包被原濃度、封閉液種類、一抗稀釋倍數(shù)、競爭反應(yīng)時間以及化學(xué)發(fā)光底物稀釋倍數(shù)等參數(shù)對檢測性能的影響；通過比較半抑制濃度IC50及RLUmax/ IC50比值作為評價各影響因素的標(biāo)準，確定最優(yōu)反應(yīng)條件[13]。

1.2.4 標(biāo)準曲線的建立

按照以上確定好的優(yōu)化條件進行化學(xué)發(fā)光檢測實驗，以DiAcSpm濃度為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準曲線。本研究以IC50值作為方法的靈敏度，以IC25值作為最低檢測限。

1.2.5 尿液樣品前處理

由于尿液成分復(fù)雜，可能會干擾對DiAcSpm含量的檢測，在實際檢測時必須對樣品進行前處理，以降低樣品本身對檢測的影響。本實驗嘗試不同的樣品稀釋液及不同的稀釋倍數(shù)，通過添加回收實驗確定了尿液樣品的前處理方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

通過對實驗參數(shù)進行摸索，確定了實驗參數(shù)：包被原濃度為2.5μg/mL；封閉液為脫脂奶粉/PBS；一抗稀釋倍數(shù)為3000倍；競爭反應(yīng)時間為30min；HRP-山羊抗兔IgG的稀釋倍數(shù)為1×104倍；化學(xué)發(fā)光底物稀釋4倍。在此基礎(chǔ)上，本實驗建立化學(xué)發(fā)光免疫分析法的標(biāo)準曲線，見圖2，得到線性回歸方程：

該檢測方法的靈敏度(IC50)為(1.74±0.09)ng/mL (n＝3)，最低檢出限(IC25)為(0.19±0.04)ng/mL (n＝3)。

2.2 尿液樣品前處理研究

本實驗以魚皮膠為掩蔽劑，通過不同濃度的溶液稀釋DiAcSpm而得到不同的抑制曲線，將其與標(biāo)準曲線比較后，選取了抑制曲線重合程度最好的0.5%魚皮膠/PBS溶液為尿液樣品稀釋液。本實驗在尿液樣品稀釋2倍、5倍、10倍和20倍的基礎(chǔ)上分別進行了添加回收實驗，通過計算回收率的高低來確定樣品稀釋倍數(shù)。結(jié)果如表1所示：以2倍稀釋尿樣測得樣本添加回收率為98.2%～151.8%，以5倍稀釋尿樣測得樣本添加回收率為92.8%～104.1%，以10倍稀釋尿樣測得樣本添加回收率為79.7%～118.9%，以20倍稀釋尿樣測得樣本添加回收率為86.3%～135.2%，由此可見各個稀釋倍數(shù)均能滿足該檢測方法所需的準確度，但是為了減少尿液稀釋倍數(shù)且盡量減少尿液本身對檢測的影響，確保檢測結(jié)果的準確性，最終選擇以0.5%魚皮膠/PBS溶液稀釋5倍的處理方法。

表1 尿樣前處理中稀釋倍數(shù)選擇的結(jié)果Tab.1 Results of dilution fold selection in urine sample pretreatment

2.3 樣品準確性研究

本實驗選取了3份正常人尿液樣本，分別向其中添加了25ng/mL、50ng/mL和100ng/mL N1,N12-二乙酰精胺，在最佳實驗條件下測定并計算回收率。結(jié)果見表2。該方法的回收率在80.02%～102.69%之間，準確度和穩(wěn)定性較好，可用于實際樣品檢測。

表2 尿液樣本中N1,N12-二乙酰精胺回收率測定(n＝3)Tab.2 Determination of recovery rate of N1,N12-diacetylspermine in urine samples(n＝3)

3 結(jié)論

本研究利用多克隆抗體建立的用于檢測人體尿液樣本的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，具有靈敏度高、準確度好，樣品前處理簡單等優(yōu)點。其靈敏度(IC50)為(1.74±0.09)ng/mL，最低檢出限(IC25)為(0.19±0.04)ng/mL，尿液樣品的添加回收率為80.02%～102.69%。本研究將為N1,N12-二乙酰精胺的高效定量檢測提供借鑒，為開發(fā)快速檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)，從而有利于在臨床上進行癌癥患者的早期篩查及預(yù)后評估。