張 衡，熊 濤，覃先武，盧 發(fā)，匡金寶，許引虎

（1.湖北省酵母功能重點實驗室，湖北宜昌443003； 2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

酵母應用史和人類的發(fā)展史一樣源遠流長，在人類的社會生活中扮演著重要角色[1]。在釀酒行業(yè)，葡萄酒領域是規(guī)?；褂没钚愿山湍笗r間最早、范圍最廣、技術最成熟的行業(yè),在20世紀60年代初,歐美各國的葡萄酒產(chǎn)區(qū)均已開始使用葡萄酒活性干酵母。我國從20世紀80年代末開始接觸葡萄酒活性干酵母，在1997年，由位于中國湖北宜昌的中國食用酵母基地（現(xiàn)安琪酵母股份有限公司）推出了中國第一個本土葡萄酒活性干酵母1450，填補了中國本土葡萄酒活性干酵母的空白[2]。商業(yè)化活性干酵母具有方便儲存、運輸快捷、使用操作靈活等綜合優(yōu)點，在活性干酵母的生產(chǎn)過程中會對酵母細胞進行脫水干燥處理，最終制成的活性干酵母含水量在4.0%～8.0%之間[3]。在酵母生產(chǎn)的干燥脫水環(huán)節(jié)，會采用多種物理和生物工程技術，使酵母細胞失去所有的自由水和大部分的結合水，水分的缺失導致細胞膜水化層的喪失，為了避免葡萄酒酵母在干燥過程中的損傷，傳統(tǒng)工藝會選擇添加適量的乳化劑來保護酵母細胞，使活性干酵母產(chǎn)品達到相應的產(chǎn)品質量標準，滿足食品發(fā)酵的技術需要[4]。2000—2010年中國葡萄酒產(chǎn)量保持了年均20%的復合增長率，在2010年突破了100萬t[5]。工業(yè)生產(chǎn)中葡萄酒活性干酵母起酵速度過快，葡萄汁泡沫極其豐富，有很大的葡萄汁溢出風險。本試驗探索酵母細胞在脫水干燥的后處理過程中乳化劑對葡萄酒活性干酵母在發(fā)酵過程中酵母細胞形態(tài)、活細胞數(shù)、葡萄酒的發(fā)酵周期、最終的發(fā)酵產(chǎn)品質量、起酵速度等方面的影響。目的是在不影響發(fā)酵周期和葡萄酒最終品質前提下降低葡萄酒活性干酵母在發(fā)酵過程中的起酵速度，以防止發(fā)酵過快的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌種：釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)RV002，由安琪酵母股份有限公司生物技術研究院菌種庫提供。

試劑：糖蜜、乳化劑、酵母抽取物、硫酸鎂、硫酸鋅等，均由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)技術中心提供。

儀器設備：BK1301生物顯微鏡，南京庚辰科學儀器有限公司；NRY-2110恒溫搖床，上海南榮實驗室設備有限公司；HDS-16-5鹵素電子水分儀，上海方瑞儀器有限公司；C20-2小型自動發(fā)酵罐，德國貝朗公司；TDL-40B高速離心機，上海安亭科學儀器廠；J26XP高速離心機，美國貝克曼公司；WBF-2G小型干燥床，重慶英造粒包衣技術格有限公司；E-50小型造粒機，重慶英造粒包衣技術格有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)

種子搖瓶培養(yǎng)：蔗糖100 g、酵母抽取物FM888 20 g、硫酸鎂、磷酸二氫鉀適量，定容至1 L，調節(jié)pH值，在180 r/min、30℃的搖床中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 酵母的發(fā)酵

底物滅菌：將適量的MgSO4、ZnSO4、酵母抽取物定容至9 L，添加酸堿液調節(jié)pH值，121℃滅菌30 min。

接種：在無菌的條件下將1.2.1中的1 L種子搖瓶培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中。

發(fā)酵：用糖蜜作為碳源，硫酸銨作為氮源，磷酸二氫銨作為磷源進行發(fā)酵。pH值控制在3.3～6.8，轉速在300～600 r/min，通風量控制在8～40 L/min，溫度控制在29～36℃，等待酵母成熟后進行吹風，留酵母樣進行下一步實驗[6]。

1.2.3 酵母的干燥[7]

干燥工藝流程：酵母乳添加乳化劑/不添加乳化劑→過濾→造?！稍铩?/p>

操作要點：

①酵母乳的過濾：乳化劑用80～90℃的熱水配制,可按每100 L水里加12.5 kg配制，配好后保持65～70℃在壓濾之前加入酵母乳中(加入的百分比為酵母乳折干后的百分比)，并保證混合均勻。

②板框壓濾：板框壓濾后的酵母塊水分在65%以下。

③干燥：進入干燥床的空氣濕度小于6 g/kg。進風溫度控制在60℃，物料品溫控制在52℃，干燥時間30 min。

1.2.4 干酵母指標檢測

蛋白質、五氧化二磷、海藻糖、其他微量成分的檢測參考安琪酵母股份有限公司Q/YB.J 06.101—2016《酵母生產(chǎn)過程分析方法》。

1.2.5 酒樣常規(guī)理化指標測定

酒精、殘?zhí)?、總酸、揮發(fā)酸的測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析法》。

1.2.6 模擬葡萄汁配制

模擬葡萄汁配制，參考OIV國際技術標準進行配制，培養(yǎng)基由儲液A、儲液B、儲液C三部分組成。

儲液A：在375 mL蒸餾水中加入蔗糖240 g/L定容至500 mL。

儲液B：在250 mL蒸餾水中加入6 g/L酒石酸、3 g/L蘋果酸、0.5 g檸檬酸。

儲液C：在250 mL蒸餾水中加入6 mg肌醇、0.2 g氯化鈣、1.7 g YNB（參照表1），以及氮源（1 g/L DAP，1 g/L FM888）。

表1 YNB培養(yǎng)基 (μg/L)

將儲液A、B、C混合后用4 mol/L氫氧化鉀調節(jié)pH3.5。

1.2.7 活性干酵母發(fā)酵性能檢測

采用250 mg/L的接種量，將稱量好的活性干酵母提前放入10 mL的試管中，按照常規(guī)活化工藝規(guī)程，加入10倍酵母質量的38℃去離子水，使葡萄酒活性干酵母溶解完全[8]，將帶有復水活化液的試管放入38℃的恒溫水浴鍋中活化20 min，再逐步加入少量的葡萄汁模擬汁，待酵母活化液的溫度降至與葡萄模擬汁溫差在10℃以內時，將酵母活化液接種到裝有葡萄汁模擬汁的500 mL三角瓶中，每瓶裝250 mL葡萄模擬汁，每個樣品3個重復[9-10]。

1.2.8 發(fā)酵過程中細胞形態(tài)的觀測

發(fā)酵過程中每24 h取1 mL發(fā)酵液用顯微鏡觀察酵母的形態(tài)并拍照記錄，觀察發(fā)酵酵母細胞大小、細胞形狀、出芽率、內含物、液泡等形態(tài)的改變[11]。

2 結果與分析

2.1 葡萄酒活性干酵母理化指標的檢測

從表2可知，不加乳化劑和加乳化劑的活性干酵母在蛋白質、五氧化二磷以及海藻糖方面差距在2%以內，無顯著性差異。未加乳化劑的酵母細胞總數(shù)比加乳化劑的細胞總數(shù)多4%，差距不顯著，在活細胞率方面，未加乳化劑的活性干酵母活細胞率比添加乳化劑的活細胞率少11%，有顯著的差異?？梢?，乳化劑對葡萄酒活性干酵母的活細胞率是存在顯著影響的。

表2 葡萄酒活性干酵母理化指標對比

2.2 酵母干燥過程中加乳化劑和不加乳化劑發(fā)酵動力的對比

從表3、表4和圖1可知：

表3 發(fā)酵過程中失重情況

表4 運用minitab回歸模型方差分析

圖1 發(fā)酵每天失重差異性對比圖

（1）起酵速度的影響：添加乳化劑的酵母第1天失重在6.24 g，未添加乳化劑的酵母第1天失重在1.88 g，未加乳化劑酵母起酵速度是添加乳化劑起酵速度的30%，P值＜0.0001，差異極顯著，可見不添加乳化劑可以極顯著降低葡萄酒酵母的起酵速度。

（2）發(fā)酵峰值的影響：第3天葡萄酒酵母發(fā)酵達到峰值，其中未加乳化劑的酵母發(fā)酵失重為12.6 g/L，添加乳化劑的酵母失重為11.4 g/L，未加入乳化劑的酵母峰值大于加乳化劑酵母的峰值10%，P值0.051，差異性不顯著，可見未加乳化劑的葡萄酒酵母不會影響其在發(fā)酵過程中峰值的表現(xiàn)。

（3）對發(fā)酵時間的影響：添加乳化劑和未添加乳化劑的酵母均在7 d完成發(fā)酵（以每天失重小于1 g/L判斷發(fā)酵結束），可見對酵母發(fā)酵周期無影響。

綜上，不加乳化劑的活性干酵母的起酵速度會極其顯著的變慢，但對發(fā)酵峰值影響不顯著，對發(fā)酵周期沒有影響。

2.3 發(fā)酵過程中酵母的細胞數(shù)

從表5可以看出，第1天未加乳化劑的酵母和加乳化劑的酵母的活細胞數(shù)相差14%，差異顯著。但從第2天直至發(fā)酵結束，酵母的活細胞數(shù)趨于一致，經(jīng)minitab計算P值為0.985，無顯著的差異，且與發(fā)酵應用中驗證一致。

表5 發(fā)酵過程中細胞數(shù)目的變化 (×107個/mL)

從顯微鏡中可以看出發(fā)酵第1天為酵母主要的出芽時間，隨后酵母出芽較少甚至沒有觀察到，出芽率與酵母活細胞數(shù)的趨勢一致，出芽率越高的細胞數(shù)越大，發(fā)酵第7天觀察到酵母未加乳化劑和加入乳化劑的死亡率分別為14.73%、15.57%。在發(fā)酵過程中，酵母未加乳化劑和加入乳化劑的形態(tài)無明顯的差異，酵母在發(fā)酵過程中出現(xiàn)幾乎是圓形形狀、大小不均一，最終細胞數(shù)目兩者幾乎一樣。可見，酵母干燥過程中未添加乳化劑對酵母在發(fā)酵過程中的形態(tài)和最終活細胞數(shù)目無顯著影響。

2.4 發(fā)酵完成后模擬葡萄酒的常規(guī)理化檢測

從表6可知，通過葡萄模擬汁的常規(guī)理化檢測發(fā)現(xiàn)，兩者的殘?zhí)蔷? g/L以下[12]，均能完成發(fā)酵，最終發(fā)酵的葡萄模擬汁酒精度、揮發(fā)酸、總酸、pH值均無顯著差別。

表6 葡萄酒常規(guī)理化指標

未加乳化劑酵母發(fā)酵的模擬汁和加入乳化劑的酵母發(fā)酵模擬汁最終酒的理化指標無明顯差異，感官小組的評定是兩者的感官無明顯差異，可見未加乳化劑的活性干酵母不會影響葡萄酒的品質。

3 結論

在本實驗中未加乳化劑會降低葡萄酒活性干酵母活細胞數(shù)，但在發(fā)酵開始后的第2天直至發(fā)酵結束兩者的活細胞數(shù)目趨于一致，活細胞數(shù)目無顯著的差異。也不會影響葡萄酒酵母在發(fā)酵過程中形態(tài)、最終活細胞數(shù)目、葡萄酒的發(fā)酵周期、葡萄酒模擬汁理化指標，且通過感官小組的評定葡萄模擬汁的品質無明顯差異。

未加乳化劑的活性干酵母起酵速度是添加乳化劑發(fā)酵速度的30%，不添加乳化劑的活性干酵母可以極顯著降低葡萄酒酵母的起酵速度，這樣可以降低葡萄酒生產(chǎn)過程中第1天的發(fā)酵速度，減少葡萄汁泡沫的生成從而降低葡萄汁溢出的風險。