王卓, 李海翩, 陳小紅

1.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心,廣東 廣州 510620; 2.中山大學附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510080

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是一種起源于黑色素細胞的高度惡性腫瘤，具有高度侵襲性且極易發(fā)生轉移，主要累及皮膚及粘膜[1]。惡性黑素瘤確診時，腫瘤細胞的異型性是確定病變組織良惡性的重要指標，而組織切片中濃密黑色素顆粒的遮擋，會影響病理醫(yī)生的觀察，且對免疫組化染色結果的識別判斷帶來困難。在臨床病理研究中，常對腫瘤標本脫色素處理后再進行免疫組化檢測，但脫色素后極易引起切片組織脫落，一直是研究者困擾的問題之一[2]。

本研究選取2例惡性黑素瘤患者的組織切片進行高錳酸鉀/草酸脫色素處理[3]，其中每例患者選取20張切片，每種脫色素方法中，取1張切片進行HE染色，4張切片應用免疫組化法檢測Stathmin的表達，探討脫色素技術在惡性黑色素瘤免疫組化研究中的應用條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選自中山大學附屬第一醫(yī)院病理科2例經病理診斷為惡性黑素瘤[1]的存檔蠟塊，經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋后，切成4 μm厚的連續(xù)切片備用。高錳酸鉀和草酸為廣州化學試劑廠產品；PBS緩沖液及檸檬酸修復液為Boster生物公司產品；蘇木素染色液及伊紅水溶液為Leagene公司產品；Stathmin為CST公司產品；MaxVisionTM試劑盒及DAB顯色液試劑盒為福州邁新公司產品。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗；脫色素處理；此后步驟同HE常規(guī)操作流程。

1.2.2 免疫組化染色 烤片、脫蠟、水化、抗原修復；脫色素處理；此后步驟同免疫組化常規(guī)操作流程。

1.2.3 脫色素處理 設置4種不同高錳酸鉀草酸濃度及處理時間：①0.5%高錳酸鉀滴片，室溫處理10 min，2%草酸浸洗5 min，PBS浸洗5 min×2次；②0.25%高錳酸鉀滴片，室溫處理10 min，2%草酸浸洗5 min，PBS浸洗5 min×2次；③ 0.25%高錳酸鉀滴片，室溫處理3 min，2%草酸浸洗3 min，PBS浸洗5 min×2次；④在石蠟切片脫蠟之后進行后固定，即脫色素之前用4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水洗，0.25%高錳酸鉀滴片，室溫處理3 min，2%草酸浸洗3 min，PBS浸洗5 min×2次。觀察不同處理后HE染色及免疫組化染色效果。

2 結果

2.1 HE染色結果

比較4種方法對既往報道過的高錳酸鉀及草酸脫色素時所使用的濃度及時間，結果(表1)顯示：方法①高錳酸鉀濃度0.5%、處理時間為10 min時，組織脫片現象嚴重，嚴重影響病理觀察及診斷；方法②降低高錳酸鉀濃度至0.25%時仍有輕微脫片現象；方法③④降低高錳酸鉀濃度至0.25%、處理時間縮短至3 min時可獲得較好的脫色效果，方法③偶發(fā)輕微脫片情況，方法④在脫色素處理前使用多聚甲醛進行固定，可進一步保證切片的完整性(圖1)，無組織脫片現象。

圖1 采用方法④對皮膚惡性黑素瘤組織切片進行脫色素處理的前后對比，脫色素前大量黑色素顆粒遮蓋了細胞形態(tài),脫色素后細胞形態(tài)清晰

表1 不同脫色素方法處理過程及結果

2.2 Stathmin免疫組化染色結果

免疫組化染色切片脫落情況與HE染色結果類似，方法①高錳酸鉀濃度為0.5%且處理時間為10 min時組織脫片現象嚴重，無法判讀；方法②中仍有輕微脫片情況，且會引起抗原抗體結合的敏感性下降，導致免疫組化染色呈弱陽性甚至假陰性；方法③能在脫色素的同時盡可能地保證組織切片的完整性以及抗原的敏感性，但仍有偶發(fā)輕微脫片現象；方法④幾乎無脫片現象，免疫組化結果呈陽性，脫色素效果可(圖2)。

圖2 三組實驗方法下皮膚惡性黑素瘤的免疫組化染色效果：未進行脫色素時，大量黑色素顆粒沉積；方法②染色呈弱陽性;方法④染色效果可

3 討論

免疫組化染色中適宜的脫色素法應同時具備以下幾個條件：脫色素效果較好；細胞形態(tài)未發(fā)生破壞，組織無丟失或脫落；組織抗原的特異性及敏感性未發(fā)生改變。免疫組化過程中，組織內的抗原與特異性抗體結合，DAB顯色后大多呈現棕黃色顆粒，但惡性黑素瘤細胞中常含有大量濃重粗大的黑色素顆粒，造成組織結構和細胞形態(tài)不清楚，嚴重干擾HE染色下細胞形態(tài)的觀察及免疫組化染色情況的判斷，從而導致診斷困難。

黑色素由黑色素母細胞的粗面內質網和高爾基體合成，是一種不含鐵而含硫的色素，性質非常穩(wěn)定，完全不溶于水，且不溶于大多數有機溶劑，但可以被高錳酸鉀、過氧化物等強氧化劑漂白[4]。脫色原理是打開黑色素的酚環(huán)，使黑色素脫色。組織切片脫色素的方法有很多，包括高錳酸鉀草酸法、過氧化氫脫色法、氯化鉀乙醇鹽酸法及溴水脫色法等[5-7]，其中高錳酸鉀草酸法及過氧化氫法最常用[8]。McGovern等[9]研究顯示高錳酸鉀草酸法較過氧化氫法而言具有操作簡便、脫色素徹底、不易脫片等特點，故本實驗中選用高錳酸鉀草酸法進行脫色素處理。

既往傳統(tǒng)的高錳酸鉀草酸法脫色素費時長,且長時間的浸泡易造成組織脫片，并且改變組織的抗原性[10]。王從陽等[10]發(fā)現使用0.25%高錳酸鉀處理標本，脫色素效果好且無脫片現象。Kligora等[11]研究發(fā)現高錳酸鉀濃度在0.125～0.5 g/L時，黑色素顆粒不能完全去除，然而當增加高錳酸鉀溶液濃度時，可能會出現細胞形態(tài)改變，或出現大量無結構的“影子”細胞，甚至出現組織丟失或脫片。郭以河等[3]發(fā)現0.5%高錳酸鉀溶液處理5 min聯合2%草酸溶液處理2 min后色素基本祛除，HE染色細胞形態(tài)清晰，免疫組化表達效果良好。Orchard等[12]發(fā)現使用高錳酸鉀草酸脫色素法會引起某些抗原的特異性及敏感性發(fā)生改變。林興滔等[13]發(fā)現利用0.1%高錳酸鉀進行褪黑色素耗時短、脫色素完全，且可保存更多抗原信號；而相同的脫黑色素時間對于不同抗原的影響程度不一致，脫色素時間的延長會影響抗原的表達從而出現假陰性率升高。本實驗結合既往研究結果在前期的預實驗中發(fā)現，使用0.25%高錳酸鉀溶液及2%草酸溶液為脫色劑，處理時長控制在3 min時，不僅極少發(fā)生脫片現象，同時保證較好的脫色素效果及保證組織的抗原活性不受影響。實驗過程中發(fā)現當高錳酸鉀濃度提高時，脫色素效果雖好，但組織切片脫片的概率也隨之升高；當高錳酸鉀處理時間過長時，抗原的敏感性下降，造成免疫組化染色結果呈現假陰性。

為進一步探討脫色素組織的免疫組化效果，本實驗將黑素瘤脫色素處理和免疫組化染色結合，發(fā)現經高壓抗原修復后再脫色素處理，脫色顆粒效果佳，組織不易脫片。在本實驗過程中曾嘗試在抗原修復之前就進行脫色素，結果發(fā)現組織脫片情況嚴重，無法進行后續(xù)的免疫組化染色。出現這一現象的原因推測可能是由于抗原修復這一步驟本身就極易造成組織的破壞和脫落，假如在這之前使用高錳酸鉀/草酸進行脫色素處理，組織與玻片間的黏附性受到破壞，在抗原修復時，不斷沸騰的高溫液體極易引起組織破壞、缺失及脫落。唐潔等[14]認為先進行脫色素而后進行抗原修復出現組織脫片嚴重的原因是脫色素時強氧化劑作用于切片，破壞了載玻片上涂膠多聚賴氨酸陽離子基團的結構，組織和載玻片黏附性降低。故本實驗中，黑素瘤切片標本先進行抗原修復，再用4%多聚甲醛進行后固定，而后使用0.25%高錳酸鉀及2%草酸進行脫色素，可得到較好的脫色素效果及免疫組化效果。

本研究結果顯示，采用0.25%高錳酸鉀溶液及2%草酸溶液進行脫色素處理，時間控制在3 min時，組織的抗原性依然保持良好，未脫色素及脫色素后的抗原表達情況基本一致，是適用于惡性黑素瘤的HE染色及Stathmin免疫組化染色的脫色素方法，值得進行臨床參考和推廣。但不同的抗原對脫色素時間的把握不同。故建議首次使用的抗原標記進行免疫組化染色需脫色素時，進行預實驗探索合適的脫色素濃度及時間。