樸莉玲

深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東 深圳 518116

尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris)作為一種常見的慢性炎癥性皮膚疾病，主要是因為皮膚受到損傷部位炎癥細(xì)胞發(fā)生浸潤以及毛細(xì)血管出現(xiàn)擴(kuò)張而引發(fā)的表皮過度增殖[1-2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，該病發(fā)病機(jī)制主要是因為CD4+T淋巴細(xì)胞免疫功能出現(xiàn)異常，活化的T細(xì)胞亞群在疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[3]，其中Th17細(xì)胞在體內(nèi)能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[4]，Treg細(xì)胞在體內(nèi)則能夠介導(dǎo)免疫抑制反應(yīng)的發(fā)生，二者失衡會引發(fā)損害機(jī)體反應(yīng)的發(fā)生[5]。Th17細(xì)胞通過誘導(dǎo)皮膚局部炎性反應(yīng)的方式，破壞皮膚組織，尋常型銀屑病發(fā)病時Treg和Th17的平衡性均出現(xiàn)異常，而治療后則恢復(fù)到健康者的水平[6]，證實Treg和Th17的水平改變與尋常型銀屑病有一定的相關(guān)性[7-8]。microRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA分子。目前有關(guān)尋常型銀屑病患者體內(nèi)miRNA的相關(guān)研究仍然處于基因表達(dá)以及特征基因庫的初始建立階段，對于miR-124在該類患者體內(nèi)發(fā)揮的功能以及基因靶點治療也未見深入性研究。大量研究均表明miR-124參與表皮細(xì)胞的生長分化以及凋亡等重要過程，但對其在疾病中的特異性表達(dá)和發(fā)揮機(jī)制仍不明確[9-10]。miR-124在尋常型銀屑病患者中可能存在差異表達(dá)，抑制促炎性細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)，在尋常型銀屑病的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[11]。為進(jìn)一步研究miR-124與尋常型銀屑病的關(guān)系，本研究選取100例尋常型銀屑病患者，分析miR-124表達(dá)與Th17和Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年5月—2020年10月于深圳市龍崗中心醫(yī)院治療的尋常型銀屑病斑塊型患者100例，其中男58例，女42例;年齡18～35歲，平均(25.24±6.18)歲;進(jìn)行期47例，穩(wěn)定期53例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《臨床皮膚病學(xué)》尋常型銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，且經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實；②1個月內(nèi)未服用過任何免疫抑制劑或皮質(zhì)類固醇激素；③均已簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期急性感染者；②合并嚴(yán)重的心、肝、腎等器官功能衰竭者；③妊娠及哺乳期患者；④不能配合完成本次試驗者。同時選擇同期在我院體檢健康者50例作為對照組，其中男29例，女21例，年齡18～35歲。銀屑病進(jìn)行期組、穩(wěn)定期組、對照組3組一般資料(表1)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審批。

表1 三組受試者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及設(shè)備 腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)、白細(xì)胞介素-21(IL-21)和白細(xì)胞介素-23(IL-23)因子ELISA試劑盒(上海碧云天公司)；孤兒受體轉(zhuǎn)錄因子(related orphan receptor，RORγt mRNA)和叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(fork head transcription factor，F(xiàn)oxp3 mRNA)引物(上海生工生物工程股份有限公司)。超低溫冰箱(上海錦玟公司)、Thermo Fisher 高速冷凍離心機(jī)(美國賽默飛公司)、Tanon GIS 2010凝膠圖像分析儀(上海天能科技有限公司)、BD公司FACSVia流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2.2 采集外周血樣本 清晨抽取所有受試者空腹?fàn)顟B(tài)下2 mL靜脈血于抗凝管中，4 ℃ 2 500 r/min離心處理10 min，取上清液貯存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2.3 PCR法檢測各組miR-124表達(dá)水平 所取血液中加入1×紅細(xì)胞裂解液，渦旋振蕩2～5 s打散細(xì)胞沉淀，加入乙醇和緩沖液等提取DNA；設(shè)計和合成引物進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增；制備瓊脂糖凝膠，采用Tanon GIS 2010凝膠圖像分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物；最后，通過PCR-RFLP及電泳分析檢測miR-124的表達(dá)水平。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測Th17和Treg細(xì)胞數(shù)量 收集血液樣本進(jìn)行裂解，細(xì)胞懸液300 g離心5 min，棄掉上清，用細(xì)胞染色緩沖液重復(fù)洗1～2次，清洗、過濾，待上機(jī)檢測。將外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行分離，通過磷酸鹽緩沖液將細(xì)胞密度調(diào)整為5×106/100 μL，取調(diào)整后的細(xì)胞懸液100 μL，分別按照順序依次加入CD3、CD4-FITC、CD4和CD25-PE單克隆抗體、同型對照抗體、IL-17、Foxp3、Foxp3-PE-Cy5和同型對照抗體，避光于室溫下孵育1 h，4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，分別加入破膜液和生理鹽水洗滌2次，離心處理棄去上清液，流式細(xì)胞儀檢測Th17和Treg細(xì)胞水平[7]。

1.2.5 ELISA法檢測各組細(xì)胞因子水平 取血清標(biāo)本采用雙抗體夾心ELISA法檢測TNF-α、IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-17、IL-21和IL-23因子水平，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 采用RT-PCR法檢測各組ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 采用Trizol法提取外周血RNA后，設(shè)計合成蛋白引物,采用RT-PCR法檢測RORγt mRNA和Foxp3 mRNA的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理。3組間miR-124表達(dá)水平、Th17和Treg細(xì)胞水平、細(xì)胞因子水平、ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA檢測結(jié)果的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，采用Logistic回歸法分析miR-124與Th17 Treg水平及與細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組間miR-124表達(dá)水平比較

對照組miR-124的表達(dá)水平為1.84±0.12，銀屑病進(jìn)行期組為0.65±0.14，穩(wěn)定期組為0.67±0.12。銀屑病進(jìn)行期組和穩(wěn)定期組均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為45.03、47.99，均P<0.05)。

2.2 各組間Th17和Treg細(xì)胞結(jié)果比較

經(jīng)統(tǒng)計分析，三組間Th17、Treg水平和Th17/Treg比值存在統(tǒng)計學(xué)差異(圖1，表2)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，對照組Th17、Treg水平和Th17/Treg比值均明顯低于銀屑病進(jìn)行期組和穩(wěn)定期組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；同時進(jìn)行期尋常型銀屑病患者Th17/Treg比值高于穩(wěn)定期，而Treg細(xì)胞比例低于穩(wěn)定期，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

圖1 三組間Th17和Treg細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

表2 各組間Th17和Treg細(xì)胞結(jié)果比較

2.3 各組間細(xì)胞因子水平比較

經(jīng)比較，三組間各細(xì)胞因子水平存在統(tǒng)計學(xué)差異(表3)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，尋常型銀屑病進(jìn)行期和穩(wěn)定期患者TGF-β的濃度低于對照組，而其他細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-21和IL-23濃度均高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。進(jìn)行期銀屑病患者TNF-α、IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-17、IL-21和IL-23水平與穩(wěn)定期比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表3 各組間細(xì)胞因子水平比較

2.4 各組間ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA檢測結(jié)果比較

三組間ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表4)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，對照組ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA表達(dá)水平均高于銀屑病進(jìn)行期和穩(wěn)定期患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。進(jìn)行期銀屑病患者ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA值與穩(wěn)定期比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表4 各組間ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA檢測結(jié)果比較

2.5 miR-124表達(dá)與Th17 Treg水平的相關(guān)性分析

經(jīng)統(tǒng)計，對照組miR-124水平與Th17和Treg之間無相關(guān)性(均P>0.05)，而銀屑病進(jìn)行期和穩(wěn)定期患者miR-124水平與Th17、Treg水平間均存在相關(guān)性(均P<0.05,表5)。

表5 miR-124表達(dá)與Th17 Treg水平的相關(guān)性分析

2.6 miR-124表達(dá)與相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性分析

銀屑病進(jìn)行期組、穩(wěn)定期組、對照組TNF-α、IL-6、ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA與miR-124表達(dá)之間均無相關(guān)性(P>0.05)，而IFN-γ、TGF-β、IL-17、IL-21和IL-23與miR-124表達(dá)相關(guān)(均P<0.05,表6)。

表6 miR-124表達(dá)與相關(guān)細(xì)胞因子及ROR-γt mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

尋常型銀屑病在我國的發(fā)病率達(dá)到了0.2%～3.0%，患者常常伴有反復(fù)的瘙癢癥狀，給患者的精神心理健康和生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響[13-14]。多數(shù)研究[15-17]表明該疾病的發(fā)生主要是抗原多肽通過抗原提呈細(xì)胞激活細(xì)胞，導(dǎo)致其他致炎性細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生增多，進(jìn)而引起皮膚損壞。

Th17細(xì)胞作為一類新型CD4細(xì)胞亞型，在體內(nèi)主要介導(dǎo)炎性反應(yīng)的發(fā)生[18]。Treg細(xì)胞表面則持續(xù)表達(dá)CD25分子[19]，故分析尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展與Th17和Treg細(xì)胞分化平衡的相關(guān)性具有重要的意義。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尋常型銀屑病患者TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-21和IL-23的濃度明顯高于對照組，TGF-β、ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA水平低于對照組；進(jìn)行期銀屑病患者細(xì)胞因子水平和ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA與穩(wěn)定期比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。miR-124水平與Th17、Treg、IFN-γ、TGF-β、IL-17、IL-21和IL-23之間均存在相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此，推測尋常型銀屑病患者Th17和Treg細(xì)胞的分化失衡與miR-124表達(dá)有關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行期尋常型銀屑病患者Th17/Treg比值較穩(wěn)定期患者高，銀屑病進(jìn)行期組和穩(wěn)定期組患者miR-124水平與Th17和Treg之間均存在相關(guān)性(P<0.05)；TNF-α、IL-6、ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA與miR-124表達(dá)之間均無相關(guān)性(P>0.05)；IFN-γ、TGF-β、IL-17、IL-21和IL-23與miR-124表達(dá)之間均存在相關(guān)性(P<0.05)。這說明進(jìn)行期患者Th17/Treg細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的失衡現(xiàn)象，推測Th17/Treg細(xì)胞失衡可能與尋常型銀屑病的發(fā)病存在密切的相關(guān)性。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124模擬物后，促炎性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-1a、IL-8和IL-12a等表達(dá)水平均不同程度降低；當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124抑制劑后，上述促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平不同程度增加[20]。由此可知，miR-124具有抑制促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的作用，因此，miR-124的異常表達(dá)在尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，尋常型銀屑病發(fā)生發(fā)展與Th17和Treg細(xì)胞的分化平衡有著密切的相關(guān)性，miR-124參與Th17和Treg細(xì)胞的分化有可能參與尋常型銀屑病的發(fā)病機(jī)制。