王國(guó)江， 陳向明， 沈文彤， 裴琴， 張海清， 何慧瓊

1.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院,上海 201318；2.上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院，上海 201802

痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes,P.acnes)是一種革蘭染色陽性的厭氧菌，是與痤瘡發(fā)病密切相關(guān)的病原微生物之一[1]。P.acnes能通過激活胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體使角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，增加皮脂分泌，使毛囊漏斗部角化，并形成炎癥反應(yīng)[2]。故抗菌治療是痤瘡治療的重要方法之一。鑒于目前抗生素耐藥問題日趨嚴(yán)重[3]，探索新型抗P.acnes藥物有重要意義。青蒿類藥物具有較高的安全性與耐受性。自制蒿甲醚乳劑對(duì)痤瘡及玫瑰痤瘡均治療有效，復(fù)發(fā)率低[4-5]，但其治療機(jī)制尚未明了。本文擬探索蒿甲醚對(duì)P.acnes的體外抑菌、協(xié)同抗菌作用及其對(duì)P.acnes菌體形態(tài)影響。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

P.acnes標(biāo)準(zhǔn)株由上海健康醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。P.acnes菌株來自上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院痤瘡患者皮疹培養(yǎng)鑒定的P.acnes，共10株。

1.2 試劑與設(shè)備

厭氧菌肉湯培養(yǎng)基(青島日水生物技術(shù)公司)，厭氧血瓊脂平板(南通凱恒生物科技)，一般血瓊脂平板及革蘭染色液(南京森貝咖公司)，厭氧袋(日本三菱公司)，蒿甲醚(華武制藥)。多西環(huán)素針(廣東衛(wèi)倫生物制藥)。掃描電子顯微鏡S-4800型(日立公司)，比濁儀(Phoenix SpecTM)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)(布魯克-道爾頓公司)。

1.3 方法

1.3.1P.acnes菌株的培養(yǎng)、鑒定與儲(chǔ)存 用無菌取樣拭子在痤瘡患者的丘疹與膿皰表面摩擦取樣，接種于厭氧培養(yǎng)基，置于厭氧袋內(nèi)37 ℃培養(yǎng)48 h。取菌落分別接種到普通及厭氧培養(yǎng)盒，再放入CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2 d取厭氧培養(yǎng)盒里的菌落，在載玻片固定，革蘭染色后鏡檢。選擇純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定菌種。確認(rèn)后的P.acnes菌株置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存待用。

1.3.2 藥物最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)檢測(cè) 測(cè)量蒿甲醚和鹽西環(huán)素對(duì)P.acnes的MIC。先將100 μL肉湯加入實(shí)驗(yàn)板的待測(cè)孔，第1排每孔加100 μL藥液，依次向下排進(jìn)行倍比稀釋，到11排為止。將蒿甲醚、多西環(huán)素分別溶解，再配制蒿甲醚與鹽酸多西環(huán)素藥液，初始濃度分別為5 000 μg/mL與2.56 μg/mL，其中鹽酸多西環(huán)素濃度是對(duì)標(biāo)組織內(nèi)溶度。將100 μL 105CFU/mL的菌液加入待測(cè)藥液內(nèi)，37 ℃厭氧培養(yǎng),48 h觀察培養(yǎng)結(jié)果，以肉眼觀察不出現(xiàn)渾濁的最低濃度為藥物的MIC，每菌株設(shè)2個(gè)平行試驗(yàn)，設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

1.3.3 聯(lián)合藥物敏感性試驗(yàn) 用微量稀釋法測(cè)定蒿甲醚及鹽酸多西環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的體外抗菌活性，重測(cè)2次，起始濃度為對(duì)應(yīng)各藥MIC的2倍。以分級(jí)抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)指數(shù)為聯(lián)合用藥敏感性指標(biāo)[6]。FIC指數(shù)≤0.5為兩藥協(xié)同作用；>0.5～1為兩藥相加作用；>1～2為兩藥無關(guān)作用；>2為兩藥拮抗作用。FIC指數(shù)=(A藥聯(lián)合MIC/A藥單測(cè)MIC)+(B藥聯(lián)合MIC/B藥單測(cè)MIC)。

1.3.4 電鏡觀察兩組菌體形態(tài) 取100 μL濃度為105CFU/mL的P.acnes標(biāo)準(zhǔn)菌菌液，加至2 mL厭氧培養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組加入藥物濃度為MIC的蒿甲醚，對(duì)照組為不加藥物的細(xì)菌培養(yǎng)液，均培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)液；1 000 g離心10 min，取試管底部細(xì)菌，再用2%戊二醛固定2 h，采用掃描電子顯微鏡觀察兩組細(xì)菌形態(tài)的差異。每組隨機(jī)選取某個(gè)視野相鄰的10個(gè)菌體，分別測(cè)量菌體長(zhǎng)度。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，蒿甲醚體外抑菌實(shí)驗(yàn)的組間濃度比較以及實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組菌體長(zhǎng)度比較均采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌種鑒定結(jié)果

采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)分離疑似P.acnes的10個(gè)臨床菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示均與標(biāo)準(zhǔn)P.acnes菌株一致。

2.2 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

單藥組內(nèi)，蒿甲醚對(duì)P.acnes的MIC為(117.19±76.15)μg/mL，鹽酸多西環(huán)素對(duì)P.acnes的MIC為(0.08±0.05)μg/mL。聯(lián)合用藥組內(nèi)，蒿甲醚作用P.acnes的MIC為(31.96±19.58)μg/mL，而鹽酸多西環(huán)素作用P.acnes的MIC為(0.02±0.01)μg/mL。聯(lián)合用藥組蒿甲醚的MIC值與單獨(dú)蒿甲醚組的MIC值間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.03,P<0.01)。表明蒿甲醚與鹽酸多西環(huán)素聯(lián)合使用可抑制P.acnes的標(biāo)準(zhǔn)菌株與臨床菌株生長(zhǎng)，其中有5個(gè)菌株呈協(xié)同作用，6個(gè)菌株呈相加作用。詳見表1。

表1 蒿甲醚與多西環(huán)素在單藥組與聯(lián)合用藥組的MIC及FIC

2.3 菌體形態(tài)學(xué)變化

蒿甲醚作用菌株24 h后，掃描電鏡下觀察對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的菌體形態(tài),可見對(duì)照組菌體較長(zhǎng)、菌壁光滑、菌體舒展，實(shí)驗(yàn)組菌體較短菌壁粗糙、菌體相互扭曲(圖1)。測(cè)量結(jié)果顯示，對(duì)照組菌體長(zhǎng)度為(19.80±3.08)μm，實(shí)驗(yàn)組菌體長(zhǎng)度為(13.40±4.47)μm,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.04，P<0.01)。

圖1 掃描電鏡觀察兩組菌體形態(tài)

3 討論

痤瘡是一種好發(fā)于青春期、主要累及面部毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性皮膚病。中國(guó)痤瘡治療指南[7]指出,對(duì)于輕中度痤瘡，可外用林可霉素、夫西地酸等抗生素，因外用抗生素易誘導(dǎo)P.acnes耐藥，建議與維A酸類或過氧化苯甲酰等聯(lián)合應(yīng)用。故探索新型敏感抗菌藥物及聯(lián)合抗菌用藥方案有重要臨床價(jià)值。青蒿類藥物有較高安全性與耐受性，除了有抗瘧原蟲及抗炎作用外，還有抗細(xì)菌作用。近年來青蒿琥酯抗菌作用研究較多:青蒿琥酯對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有體外抑菌作用，且青蒿琥酯與頭孢西丁聯(lián)合使用，可降低頭孢西丁的MIC[8]；高濃度的青蒿琥酯對(duì)MRSA WHO-2菌的細(xì)胞壁有輕微破壞作用[9]；青蒿琥酯與不同抗菌藥物具有協(xié)同抗菌作用[10];口服青蒿琥酯治療酒糟鼻的療效與多西環(huán)素相當(dāng)，但不良反應(yīng)小[11],為青蒿類藥物治療痤瘡類等疾病提供了借鑒。

從青蒿類抗菌機(jī)制來看，青蒿類藥物的抗瘧機(jī)理是該類分子含過氧橋結(jié)構(gòu)，在血清鐵離子的介導(dǎo)下，過氧橋結(jié)構(gòu)容易發(fā)生斷裂，從而釋放氧自由基，可以直接破壞瘧原蟲的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致瘧原蟲死亡。受到此機(jī)制啟發(fā)，蔣為薇等[9]研究發(fā)現(xiàn)青蒿類藥物對(duì)MRSA WHO-2菌壁有破壞作用，但在該菌藥敏濃度以下時(shí)，對(duì)菌膜的破壞性不明顯。本研究掃描電鏡觀察表明，細(xì)菌敏感濃度的蒿甲醚對(duì)P.acne細(xì)胞壁有明顯破壞作用，菌壁表明粗糙不平，呈現(xiàn)樹皮樣結(jié)構(gòu)，可能是細(xì)菌種類不同造成的。Silva等[12]發(fā)現(xiàn)千層香精油作用于李斯特菌時(shí)，會(huì)使該細(xì)菌變短小，表明細(xì)菌在不利生長(zhǎng)的環(huán)境中會(huì)改變菌體大小，與本研究中蒿甲醚培養(yǎng)的P.acne較對(duì)照組P.acne菌體的變短小有一致性。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌一氧化氮可以對(duì)抗藥物的殺菌或抑菌作用，青蒿類藥物可結(jié)合菌體內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)的血紅素基團(tuán)滅活NOS，減少地衣芽孢桿菌產(chǎn)生一氧化氮，來增強(qiáng)利福平的抗菌作用[13]。有研究表明P.acne可通過活性氧依賴的NF-κB級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)NOS、一氧化氮的表達(dá)[14]，因此蒿甲醚與鹽酸多西環(huán)素對(duì)P.acne聯(lián)合用藥的療效也值得進(jìn)一步研究。

蒿甲醚抗瘧原蟲活性與青蒿琥酯相似[15]，我們預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同濃度的蒿甲醚乳劑較青蒿琥酯乳劑的皮膚刺激小，更適合做外用制劑。研究發(fā)現(xiàn)，2.5～20 g/L蒿甲醚可體外抑制毛囊蠕形螨活性[16]，應(yīng)用自制1%蒿甲醚乳劑對(duì)玫瑰痤瘡的有效率略高于甲硝唑膏、且8周復(fù)發(fā)率明顯降低[4]。蒿甲醚乳劑對(duì)痤瘡治療有效，且8周復(fù)發(fā)率低于夫西地乳劑[5]。本研究顯示，蒿甲醚對(duì)體外P.acnes的抑菌作用可能是治療痤瘡主要機(jī)制之一。蒿甲醚對(duì)體外P.acnes的MIC值為(117.19±76.15)μg/mL，較陳向明等[17]報(bào)道的青蒿琥酯對(duì)P.acnesMIC值(1 071± 688 μg/mL)約低9.15倍，表明其抗P.acnes的作用強(qiáng)于青蒿琥酯，為開發(fā)該藥的外用制劑治療痤瘡類疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另外，蒿甲醚與多西環(huán)素對(duì)P.acnes的協(xié)同或相加的抑菌作用，在一定程度上為外用蒿甲醚乳劑聯(lián)合口服鹽酸多西環(huán)素提供了重要啟示。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)蒿甲醚可使P.acnes菌體長(zhǎng)度縮短、菌壁粗糙、菌體互相扭曲，推測(cè)可能與該藥物影響細(xì)胞壁菌體蛋白合成有關(guān)，但其確切抗菌分子機(jī)制還有待更深入的研究。同時(shí)，有研究表明生物膜在P.acnes的感染機(jī)制中起重要作用[18]，蒿甲醚是否可以破壞P.acnes的生物膜結(jié)構(gòu)以及蒿甲醚的抗炎機(jī)制是否在治療痤瘡中發(fā)揮作用亦值得進(jìn)一步探討。