洪梓德, 楊斌

1.南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院, 廣東 廣州 510091

皮膚黑素瘤(skin cutaneous melanoma,SKCM)由黑素細胞惡變轉(zhuǎn)化而來[1]，死亡率約為60%[2]。一般認為，SKCM的預(yù)后與腫瘤中潰瘍的存在與否、腫瘤浸潤深度、有絲分裂率以及受累淋巴結(jié)數(shù)目密切相關(guān)[3]。但這些經(jīng)典的預(yù)后評估方法始終不能令人滿意[4]。因此，科學(xué)家深入研究了與腫瘤相關(guān)的分子標記物，期待通過尋找特異和敏感的生物標志物，使診斷、預(yù)后和風(fēng)險評估更加準確易行。囊泡胺轉(zhuǎn)運蛋白1(vesicle amine transport protein-1,VAT1)屬于醌氧化還原酶亞家族[5]。VAT1在膠質(zhì)母細胞瘤中高表達，并促進膠質(zhì)母細胞瘤的遷移、增殖和耐藥性的產(chǎn)生；高表達的VAT1是膠質(zhì)母細胞瘤的一個不良預(yù)后因素[6-7]。同樣，VAT1在膠質(zhì)瘤患者中的高表達是膠質(zhì)瘤患者較低生存率的潛在指標，VAT1可能參與膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的免疫抑制，成為膠質(zhì)瘤免疫治療的新靶點[8]。在肝癌中，VAT1的表達水平較高，其表達水平可有效預(yù)測肝癌的侵襲和預(yù)后[9]。進一步的研究表明，VAT1可以作為一個有希望的新靶點，圍繞這個靶點，能夠去開發(fā)針對腫瘤的遷移抑制劑[10]。在SKCM中，VAT1尚未被評估。因此，本研究采用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)和基因表達匯編(gene expression omnibus, GEO)的相關(guān)數(shù)據(jù)集，評估VAT1在SKCM中的作用。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

從公開的TCGA下載SKCM患者數(shù)據(jù)集(包括基因表達譜和臨床信息)，共472例腫瘤組織。采用TPM(transcripts per million)方法對RNA測序數(shù)據(jù)進行歸一化處理。從公開的GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE98394(包括基因表達譜和臨床信息)，共78例患者組織，排除其中27例痣組織，納入51例SKCM腫瘤組織，采用和TCGA同樣的方法處理數(shù)據(jù)。

1.2 方法

應(yīng)用基因表達譜交互分析(gene expression profiling interactive analysis, GEPIA)(http://GEPIA.cancer-pku.cn/index.html)數(shù)據(jù)庫[11]分析VAT1的表達情況并繪制生存曲線。

使用TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)[12]對VAT1在SKCM中的表達及其與免疫浸潤的相關(guān)性進行系統(tǒng)分析。

將來自TCGA的472個SKCM樣本進行基因表達數(shù)據(jù)歸一化，并上傳到CIBERSORT(http://cibersort.stanford.edu/)[13]門戶網(wǎng)站，算法以1 000個排列的默認矩陣運行,檢測22種TIICs在SKCM中的免疫應(yīng)答。為研究VAT1的表達對免疫微環(huán)境的影響，將從CIBERSORT運算后得到的樣本分為VAT1低表達組和高表達組，對比兩組之間22種TIICs的豐度，以評估VAT1與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞比例的相關(guān)性。

采用人類蛋白圖譜(the human protein atlas, HPA)[14]下載VAT1在正常人皮膚和黑素瘤中的免疫組化圖像，驗證VAT1的表達情況。

1.3 統(tǒng)計分析

采用R-4.0.3對TCGA和GSE98394獲得的數(shù)據(jù)進行合并和統(tǒng)計。采用單因素Cox分析評估VAT1表達及其他臨床病理因素(年齡、性別和stage分期)對生存率的影響，對VAT1高表達組和低表達組在GSE98394數(shù)據(jù)集中的生存時間進行對比分析，制作生存曲線圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VAT1的表達情況和生存相關(guān)性分析

排除129例臨床信息數(shù)據(jù)不足或缺失的病例，共納入343例SKCM。其中stage 0期6例(1.7%)、Ⅰ期69例(20.1%)、Ⅱ期115例(33.5%)、Ⅲ期143例(41.7%)、Ⅳ期10例(2.9%)。隨訪時間14～7 563 d,中位數(shù)為1 195 d。GEPIA顯示的箱線圖(圖1A)和HPA顯示的免疫組化圖像(圖1B、1C)表明，VAT1在SKCM中的表達明顯高于正常組織。GEPIA顯示的生存曲線(圖2A)提示SKCM中VAT1的表達增加與總生存率相關(guān)(P=0.002)，這種相關(guān)性在GSE98394數(shù)據(jù)集(圖2B)中得到驗證(P=0.004)。使用Cox回歸的單變量相關(guān)分析顯示(表1)，SKCM中stage分期和VAT1的表達水平與總生存率相關(guān)。

表1 單因素Cox回歸分析TCGA和GSE98394數(shù)據(jù)的臨床病理特征和總生存率的關(guān)系

圖1 VAT1在SKCM中的表達情況 用GEPIA分析VAT1在SKCM和正常皮膚中的mRNA表達差異(1A)；用HPA分析VAT1在SKCM(1B)和正常皮膚(1C)中的免疫組化圖像

圖2 來自GEPIA(2A)網(wǎng)站和GSE98394數(shù)據(jù)集(2B)的VAT1差異表達生存曲線

2.2 VAT1表達與腫瘤浸潤性免疫細胞的關(guān)系

有分析表明腫瘤浸潤淋巴細胞是皮膚黑素瘤患者前哨淋巴結(jié)狀態(tài)和生存率的獨立預(yù)測因子[15]。本研究將TCGA的472例腫瘤標本按VAT1表達分為高表達組和低表達組，各236例，均符合篩選標準。CIBERSORT探索下載樣本的基因表達譜，結(jié)果顯示了22個免疫細胞亞群的比例(圖3)，駐留記憶CD4+T細胞、活化的記憶CD4+T細胞、M1巨噬細胞、駐留肥大細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、活化的NK細胞、漿細胞和嗜酸性粒細胞是VAT1表達影響的主要免疫細胞。其中，駐留肥大細胞(P=0.032)、調(diào)節(jié)性T細胞(P=0.034)、活化的NK細胞(P=0.014)、嗜酸性粒細胞(P<0.01)在高表達組較低表達組明顯增多。與低表達組相比，高表達組的駐留記憶CD4+T細胞(P=0.016)、M1巨噬細胞(P=0.006)、活化的記憶CD4+T細胞(P<0.01)、漿細胞(P=0.012)減少。

圖3 SKCM中VAT1的表達水平與22種免疫細胞亞群比例的相關(guān)性分析

2.3 SKCM的免疫浸潤水平與VAT1表達和SKCM累積存活率有關(guān)

使用TIMER分析評估VAT1的表達與免疫浸潤水平的關(guān)系,結(jié)果顯示(圖4A)，在SKCM中VAT1的表達水平與低免疫浸潤相關(guān):在原位皮膚黑素瘤患者中，VAT1表達水平與CD8+T細胞浸潤水平呈負相關(guān)(r=-0.20，P<0.01)，與中性粒細胞浸潤水平呈負相關(guān)(r=-0.26，P<0.01);在轉(zhuǎn)移性皮膚黑素瘤患者中，VAT1表達水平與CD8+T細胞(r=-0.16，P<0.01)、巨噬細胞(r=-0.15，P<0.01)、中性粒細胞(r=-0.29，P<0.01)、樹突狀細胞浸潤水平均呈負相關(guān)(r=-0.12，P<0.01)。在轉(zhuǎn)移性皮膚黑素瘤中，B細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞是與SKCM累積存活率相關(guān)的因素(圖4B)。

圖4 6種免疫細胞浸潤水平與VAT1表達水平(4A)、SKCM的累積存活(4B)的相關(guān)性分析

3 討論

VAT1是一種細胞溶質(zhì)可溶性蛋白，能夠轉(zhuǎn)移磷脂酰絲氨酸[16]。VAT1也可以在多種癌癥組織中表達，包括腦、肝臟、胃等。目前尚無VAT1對SKCM的潛在預(yù)后影響報道。因此，本研究對VAT1在SKCM中的免疫浸潤和預(yù)后價值進行探討，首次分析VAT1在皮膚黑素瘤患者中的表達。

在臨床和RNA-seq數(shù)據(jù)的背景下，本研究對343例皮膚黑素瘤患者回顧性分析的結(jié)果表明，在SKCM患者中，VAT1的表達較正常人高，高表達的VAT1與SKCM的不良預(yù)后相關(guān)。此外，研究表明，SKCM中不同的免疫標記物集和免疫浸潤水平與VAT1表達相關(guān)。推測VAT1可能對腫瘤免疫學(xué)有潛在的影響。

使用在線數(shù)據(jù)庫GEPIA和單因素Cox分析發(fā)現(xiàn)，VAT1表達與SKCM患者生存率存在相關(guān)性,并且這種相關(guān)性在數(shù)據(jù)集GSE98394中得到驗證，提示VAT1表達上調(diào)與預(yù)后呈負相關(guān)。研究還觀察到VAT1在皮膚黑素瘤中過度表達，并通過HPA進一步證實。

本研究表明，在SKCM中VAT1的表達與免疫浸潤水平相關(guān)。CIBERSORT分析表明VAT1表達與SKCM中駐留記憶CD4+T細胞、M1巨噬細胞、活化的記憶CD4+T細胞和漿細胞呈負相關(guān)。同樣，不同免疫細胞的基因標記物與VAT1表達的關(guān)系也暗示了VAT1在調(diào)節(jié)SKCM腫瘤免疫微環(huán)境中的重要意義。T細胞在腫瘤微環(huán)境或周圍組織中均表現(xiàn)出抗黑色素瘤的能力[17]，這種抗黑色素瘤作用的能力在清除腫瘤細胞中起著重要作用。T細胞可以通過釋放穿孔素和顆粒酶來攻擊黑色素瘤細胞，從而導(dǎo)致細胞凋亡和新抗原在腫瘤床上的擴散[18-19]。位于腫瘤龕內(nèi)的巨噬細胞能夠吞噬死亡的黑色素瘤細胞，并將癌抗原呈遞給T細胞，以激活基于T細胞的二級適應(yīng)性免疫反應(yīng)[20-21]。因此，VAT1對SKCM的不良影響可能與T細胞和巨噬細胞的低密度有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果支持VAT1與SKCM預(yù)后和免疫浸潤的相關(guān)性。無論是在轉(zhuǎn)移性黑素瘤，還是在原位黑素瘤中，VAT1表達水平都與CD8+T細胞和中性粒細胞的浸潤水平呈負相關(guān)。而在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中，VAT1表達水平還與樹突狀細胞和巨噬細胞的浸潤水平呈負相關(guān)。研究結(jié)果強調(diào)了VAT1在SKCM中對巨噬細胞免疫浸潤的明顯影響。提示VAT1可能是SKCM低存活率的一個預(yù)后分子標志物，并與一些免疫細胞的浸潤減少相關(guān)。因此，建議對VAT1在皮膚黑素瘤中的生物學(xué)功能行進一步研究。