唐 琴 劉 珊 沈紅梅

(云南省腫瘤醫(yī)院 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合科， 云南 昆明 650118)

據(jù)統(tǒng)計(jì)肺癌發(fā)病率占腫瘤總發(fā)病率的11.6%，肺癌死亡人數(shù)占腫瘤總死亡人數(shù)的18.4%[1]。大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，部分患者已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，另一部分患者手術(shù)后仍需化療或靶向治療以延長(zhǎng)生存期和提高生活質(zhì)量。盡管放化療及靶向治療在中晚期肺癌治療中取得很大進(jìn)展，但其5年生存率仍不理想(<15%)，腫瘤耐藥性已被認(rèn)為是肺癌治療成功與否的關(guān)鍵因素[2]。越來越多強(qiáng)有力的證據(jù)支持肝癌、結(jié)腸癌、肺癌及多種腫瘤的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)與治療耐藥性相關(guān)，有實(shí)驗(yàn)表明CSCs與其他腫瘤細(xì)胞相比對(duì)化療的耐藥性更強(qiáng)[3]。CSCs主要通過延長(zhǎng)端粒、經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)及改變信號(hào)通路等方式促進(jìn)肺癌耐藥。本文依據(jù)國(guó)內(nèi)外對(duì)腫瘤干細(xì)胞在肺癌耐藥的最新研究進(jìn)展，就肺癌干細(xì)胞耐藥相關(guān)標(biāo)志物及其作用機(jī)制作一綜述。

1 CSCs概述

CSCs是存在于腫瘤中具有干細(xì)胞性質(zhì)的一小部分細(xì)胞群體。干細(xì)胞具有高度自我更新能力、自我繁殖和多向分化潛能，其主要功能是控制和維持細(xì)胞再生。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育階段，可以分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有發(fā)育全能型，可以分化為機(jī)體各種類型的細(xì)胞，成體干細(xì)胞具有自我更新能力，通常只能分化為機(jī)體特定類型的細(xì)胞。CSCs同樣具有干細(xì)胞特性，可自我更新并分化為異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞，CSCs的水平與肺癌患者死亡率增高具有相關(guān)性[4]。CSCs不僅具有逃避免疫監(jiān)視和抗凋亡的能力，在治療過程中還可獲得藥物耐受性。雖然化療及靶向治療可以殺滅大量腫瘤細(xì)胞，但CSCs可以在血液中存活，隨著CSCs在整個(gè)身體中傳播，可以遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤而選擇合適的腫瘤微環(huán)境繼續(xù)生長(zhǎng)[5]。CSCs是各種惡性腫瘤常規(guī)治療失敗的重要原因。因此，在治療過程中不僅要通過手術(shù)治療、化療以及放療等方式清除原發(fā)腫瘤組織及細(xì)胞，還需進(jìn)一步干預(yù)CSCs介導(dǎo)的耐藥性。

2 腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物

腫瘤干細(xì)胞參與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥等多個(gè)過程。因此，準(zhǔn)確的檢測(cè)出CSCs標(biāo)志物對(duì)腫瘤后續(xù)治療和評(píng)估預(yù)后具有指導(dǎo)作用。迄今為止，已經(jīng)鑒定出多個(gè)存在肺CSCs細(xì)胞表面或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的標(biāo)記物，如醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)、CD133、CD44、CD166、CD90，其中最主要的標(biāo)記物包括ALDH、 CD133、CD44[6]。

2.1 ALDH

ALDH是一組在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)且具有排毒作用的胞質(zhì)同工酶，ALDH在多種實(shí)體腫瘤中被證實(shí)其表達(dá)增加與不良預(yù)后、腫瘤干性和耐藥性有關(guān)[7]。ALDH1是其家族成員之一，近年來ALDH1已被認(rèn)為是多種實(shí)體腫瘤(包括肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等)CSCs的重要標(biāo)志物。目前臨床所用的多數(shù)化療藥物(包括順鉑、環(huán)磷酰胺等)是經(jīng)由ALDH1代謝。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，將少量的ALDH1陽性肺癌細(xì)胞注射入裸鼠時(shí)，它們具有啟動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)并產(chǎn)生異源性腫瘤的能力；然而，ALDH1陰性肺癌細(xì)胞沒有顯示出這種能力，這表明ALDH1陽性細(xì)胞可能具有自我更新能力，并分化出一個(gè)細(xì)胞群；此外，ALDH1陽性細(xì)胞對(duì)化療藥物具有高度耐藥性，而ALDH1陰性細(xì)胞對(duì)這些藥物不耐受[8]。既往研究從肺癌細(xì)胞系中分離出ALDH1陽性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其具有體外自我更新、分化和多藥耐藥性等重要的CSCs特性；此外，比較了三個(gè)不同肺癌患者人群中ALDH1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ALDH1的高表達(dá)與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)[9]。同時(shí)，在肺癌術(shù)后患者中，ALDH1陽性患者較陰性患者5年生存率明顯降低[10]。這表明ALDH不僅可以作為CSCs標(biāo)志物，也可以作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

2.2 CD133

CD133抗原也被稱為prominin 1，是一種120 kDa的5次跨膜蛋白，由prom1基因編碼，CD133基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA異常甲基化與腫瘤中CD133的異常表達(dá)有關(guān)[11]。目前CD133被認(rèn)為是乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌等多種實(shí)體腫瘤CSCs亞群的標(biāo)記物[12]。靈芝小孢子蛋白(ganoderma microsporum, GMI)在抑制CD133的同時(shí)可以降低肺癌干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)并抑制肺癌細(xì)胞活力和球體形成能力[13]。CD133陽性細(xì)胞通過高表達(dá)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G5(ATP-binding cassette transporter G5，ABCG5)和FADD樣抑制蛋白(FADD-like inhibitor protein，F(xiàn)LIP)來增強(qiáng)對(duì)化療和凋亡的抵抗[14]。Bertolini等[15]發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NCSLC)中的CD133陽性細(xì)胞群增加，并且在重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency mice, SCID)小鼠中具有更高的致瘤潛力，并且干性基因表達(dá)、粘附性、運(yùn)動(dòng)性和藥物外排率比CD133陰性細(xì)胞更高。使用含鉑方案治療NCSLC患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，CD133的高表達(dá)與無進(jìn)展生存期較短相關(guān)[15], 表明CD133可作為NSCLC患者的預(yù)后指標(biāo)。

2.3 CD44

CD44是細(xì)胞的一種跨膜糖蛋白，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、分化和運(yùn)動(dòng)過程，同時(shí)，CD44和P-糖蛋白共同介導(dǎo)細(xì)胞多重耐藥。CD44作為CSCs標(biāo)記物，在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、自我更新、轉(zhuǎn)移和治療抵抗方面發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)CD44亞群的肺癌細(xì)胞與CD44低表達(dá)組相比，具有更高的致瘤能力、腫瘤球形成能力和遷移特性[16]。用特定方法將腺癌模型中的A549細(xì)胞分為三陽性(EpCAM+/CD166+/CD44+)和三陰性(EpCAM-/CD166-/CD44-)亞群，發(fā)現(xiàn)三陽性亞群顯示出更高的增殖活性、更好的克隆形成性，并且具有更強(qiáng)的球體形成能力，這表明其具有更好的自我更新能力；同時(shí)還可觀察到在三陽性亞群中具有較高的5-氟尿嘧啶和順鉑耐藥性[17]。Leung等[18]將NSCLC患者腫瘤細(xì)胞種植在裸鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，無論是原始CD44陽性細(xì)胞還是剛分化出來的CD44陽性細(xì)胞，與CD44陰性細(xì)胞相比，都可表達(dá)OCT4/POU5F1、NANOG、SOX2等多能干基因；此外，剛篩選出來的CD44陽性細(xì)胞比CD44陰性細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受性更強(qiáng)，凋亡水平更低。因此，CD44可以作為篩選CSCs的可靠標(biāo)志物。

3 CSCs的耐藥機(jī)制

3.1 CSCs端粒酶活性增高

端粒由重復(fù)的富G序列和大量相關(guān)蛋白組成，這些蛋白形成保護(hù)染色體末端的有效帽。端粒的長(zhǎng)短和穩(wěn)定性決定了細(xì)胞壽命，并與細(xì)胞衰老和癌變密切相關(guān)。端粒酶也稱為端粒末端轉(zhuǎn)移酶，是一種核糖核蛋白復(fù)合物，可延長(zhǎng)端粒DNA重復(fù)序列以延長(zhǎng)端粒。它通過延長(zhǎng)端粒末端從而賦予細(xì)胞無限增殖的能力，在大多數(shù)腫瘤中很容易檢測(cè)到端粒酶活性，但在體細(xì)胞組織中卻不能，由此可見端粒酶活性對(duì)于干細(xì)胞的完整性和壽命至關(guān)重要[19]。已有多項(xiàng)研究表明，端粒長(zhǎng)度的增加可賦予CSCs對(duì)多種抗腫瘤療法的抵抗力。相反，端粒長(zhǎng)度的縮短與藥物敏感性有關(guān)[20]。肺癌干細(xì)胞顯示出比非CSCs具有更長(zhǎng)的端粒。無論是在體外還是體內(nèi)，使用特定的端粒酶催化活性的小分子抑制劑2-[(E)-3-nataltalen-2-yl-but-2-enoylamino]-苯甲酸(BIBR1532)處理腫瘤干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)端粒漸進(jìn)縮短，增殖能力降低以及對(duì)化學(xué)敏感性增加，對(duì)BIBR1532不敏感的細(xì)胞或從端粒酶抑制作用釋放的細(xì)胞未顯示出生長(zhǎng)能力或藥物敏感性的變化[21]。同樣，使用端粒酶抑制劑對(duì)肺癌患者具有良好抗腫瘤效應(yīng)，另外端粒酶抑制劑短期治療對(duì)腫瘤干細(xì)胞具有逆轉(zhuǎn)作用[22,23]。調(diào)節(jié)端粒酶活性是一個(gè)復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的過程，其與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)緊密相關(guān)。因此，需進(jìn)一步研究來幫助我們?cè)鲞M(jìn)對(duì)該領(lǐng)域的了解。

3.2 CSCs經(jīng)歷EMT過程

EMT使腫瘤細(xì)胞在獲得干性的同時(shí)失去極性，從而獲得運(yùn)動(dòng)能力。在腫瘤形成過程中，EMT賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的腫瘤啟動(dòng)、轉(zhuǎn)移潛能及藥物抵抗能力[24]。有研究顯示，EMT發(fā)生或EMT轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TFs)的激活賦予癌細(xì)胞干樣特征[25]。Twist1是調(diào)控EMT過程的重要轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)Twist1的表達(dá)可以促進(jìn)EMT、癌細(xì)胞遷移和腫瘤干細(xì)胞特征(包括多能性因子的表達(dá)，腫瘤球體形成的能力和干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)增加)，這說明EMT和腫瘤細(xì)胞獲得干性是存在聯(lián)系的[26]。因此我們認(rèn)為，部分CSCs可能經(jīng)歷EMT過程，并獲得侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥的能力，這可能是引起治療療效不佳的主要因素。然而，Chen等[27]和Tiran等[28]在肺癌中發(fā)現(xiàn)，上皮表型CSCs比間質(zhì)表型CSCs具有更高的腫瘤形成能力和化學(xué)抗性。這一觀點(diǎn)的提出，對(duì)間質(zhì)型CSCs引起腫瘤啟動(dòng)和藥物治療抵抗模型來說是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)這一觀點(diǎn)。

3.3 CSCs信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異常激活

3.3.1 Wnt/β-Catenin信號(hào)通路

Wnt主要包含3條信號(hào)通路，其中最具代表性的Wnt/β-Catenin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Wnt/β-catenin是一種進(jìn)化保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它主要參與細(xì)胞的增殖、存活、運(yùn)動(dòng)、分化和凋亡等過程。氯化白屈菜堿是一種苯并菲啶生物堿，可以通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路從而抑制肺癌干細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及球體形成能力[29]。伊曲康唑在體外通過抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，改變肺癌干性特征，但不影響細(xì)胞生存力，這表明伊曲康唑可能成為抑制肺CSCs的一個(gè)靶向藥物[30]。在體外激活肺癌細(xì)胞Wnt/β-Catenin途徑，再用不同濃度順鉑處理A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的耐藥性均有不同程度的增強(qiáng)，并且CSCs相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，在高表達(dá)Oct4和Nanog且對(duì)吉非替尼耐藥的兩個(gè)肺癌細(xì)胞系中，β-catenin染色明顯，且Wnt信號(hào)通路相關(guān)mRNA及蛋白過表達(dá)，細(xì)胞經(jīng)歷EMT過程，這說明激活Wnt/β-Catenin通路可使肺CSCs獲得耐藥性，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT[32]。

3.3.2 Hedgehog信號(hào)通路

Hedgehog(Hh)信號(hào)通路在人類胚胎形成的早期，器官發(fā)育過程中被生理激活，而異常激活可導(dǎo)致各種腫瘤的發(fā)生[33]。最早在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)Hh途徑對(duì)維持CSCs特性至關(guān)重要，隨后在各種實(shí)體瘤中也得到同樣結(jié)果。Hh通路被過度激活，肺成纖維細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物，并獲得分化能力和免疫抑制潛能。ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由ATP水解供能將結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的小分子(例如環(huán)磷酰胺、順鉑等)向細(xì)胞外排出。正常干細(xì)胞和肺癌CSCs中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)升高，化療藥物從胞內(nèi)排出，從而降低藥物療效[34,35]。

Hh途徑可通過上調(diào)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及發(fā)生EMT從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類耐藥，然而抑制Hh途徑能夠增加細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的敏感性，并降低CSCs表型的表達(dá)[36,37]。在體外肺癌細(xì)胞模型中，miR-182-5p可通過下調(diào)Hh途徑的轉(zhuǎn)錄蛋白，即神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白(glioma-associated oncogene homolog，GLI)來增加細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[38]。研究表明，SHH信號(hào)通路的成分在耐吉非替尼的具有干細(xì)胞特性的PC9GT細(xì)胞中高度表達(dá)，然而抑制SHH途徑可逆轉(zhuǎn)PC9GT對(duì)吉非替尼的耐藥性[39]。Sox2為胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)維持肺腺癌CSCs的自我更新尤為重要。調(diào)節(jié)Hh通路抑制Sox2的表達(dá)，不僅可以減低肺癌CSCs的自我更新能力和細(xì)胞活力，還可以增加肺癌CSCs對(duì)順鉑和吉非替尼的敏感性[40]。

由此可見，Hh通路在肺癌干性及耐藥性的維持中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，Hh可以作為肺癌的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。

3.3.3 Notch信號(hào)通路

Notch是高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，介導(dǎo)細(xì)胞分化、增殖、存活和凋亡[41]。最近研究表明，miRNA在調(diào)控CSCs特性中起關(guān)鍵作用。Jiang等[42]發(fā)現(xiàn)，miR-1275可通過激活Notch信號(hào)，增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的干性；拮抗miR-1275或抑制Notch通路可有效逆轉(zhuǎn)miR-1275誘導(dǎo)的通路共激活和干性特征。高Nocth活性的肺腺癌細(xì)胞亞群在血清中培養(yǎng)或連續(xù)異代種植發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞亞群不僅可形成腫瘤球，還能產(chǎn)生異質(zhì)細(xì)胞群；而阻斷Notch信號(hào)通路則使該細(xì)胞亞群?jiǎn)适鲜瞿芰Γ挥没熕幬锓謩e作用于高Nocth活性和低Nocth活性的肺腺癌細(xì)胞后，低Nocth活性的細(xì)胞活力降低，提示高Nocth活性的細(xì)胞具有更強(qiáng)的化學(xué)抗藥性[43]。上述結(jié)果表明，Notch信號(hào)的異常激活可以增強(qiáng)肺CSCs特性，增加耐藥性，導(dǎo)致預(yù)后不良。

4 總結(jié)及展望

化療及靶向治療，可與手術(shù)、放療等治療方式相互配合以延長(zhǎng)肺癌患者的生命。如何增加肺癌細(xì)胞對(duì)藥物敏感性，以及尋找新的治療靶點(diǎn)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。近年來多項(xiàng)研究表明，肺CSCs通過延長(zhǎng)端粒、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、異常激活信號(hào)通路以及表達(dá)抗藥性蛋白等方式在藥物抵抗中發(fā)揮重要作用。目前臨床上針對(duì)肺CSCs的特異性藥物尚有待開發(fā)，相信隨著對(duì)CSCs標(biāo)志物和耐藥機(jī)制不斷深入了解，研發(fā)針對(duì)CSCs的藥物有望成為治療肺癌和逆轉(zhuǎn)肺癌抗藥性的新方向。