婁瑩瑩， 李佃貴， 霍永利， 賈 寧， 徐偉超， 王亞敏， 李 燕

(1.河北省中醫(yī)院脾胃病三科，河北 石家莊 050017；2.唐山市血液中心，河北 唐山 063000；3.河北滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061012；4.河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，河北 石家莊 050091)

潰瘍性結(jié)腸炎屬于炎癥性腸病，是一種原因、發(fā)病機(jī)制不完全明確的慢性非特異性腸道疾病。本病反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈，已經(jīng)成為公認(rèn)的世界難題。隨著我國疾病譜的變化，我國潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率逐年上升，且成為結(jié)腸腫瘤的重要危險(xiǎn)因素[1]。越來越多的研究表明，結(jié)腸上皮細(xì)胞的異常凋亡可能進(jìn)一步影響腸黏膜的屏障功能，腸黏膜被破壞或功能喪失，從而導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生[2-3]。因此抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的過度凋亡，使增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡，形成堅(jiān)固的黏膜保護(hù)屏障，是臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎的有效途徑。國醫(yī)大師李佃貴教授提出潰瘍性結(jié)腸炎濁毒致病論，并以化濁解毒法為基本治療大法，形成化濁解毒有效方劑，前期研究表明，該法可調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，發(fā)揮抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞凋亡角度驗(yàn)證化濁解毒法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜的保護(hù)作用，揭示其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物 化濁解毒方由白頭翁15 g、藿香12 g、黃連12 g、茵陳15 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮12 g、當(dāng)歸12 g、芍藥20 g、茯苓15 g、白術(shù) 6 g、廣木香9 g、秦皮15 g、地榆12 g、兒茶6 g、苦參9 g、仙鶴草15 g組成，購于河北省中醫(yī)院，藥材煎制并濃縮至所需濃度備用，在4 ℃下保存，低、高劑量分別相當(dāng)于成人用量(3.33 g/kg)的6.25、12.5倍，按20.8、41.6 g/kg給藥。美沙拉嗪腸溶片(250 mg/片，黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司)研成細(xì)粉，溶于蒸餾水，配制成0.3 g/mL溶液。

1.2 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量(220±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(冀)2018-008，動(dòng)物合格證編號(hào)1808139。

1.3 試劑 三硝基苯磺酸(美國Simga公司)；兔抗大鼠Bax單克隆抗體(批號(hào)bs-0127R)、caspase-9單克隆抗體(批號(hào)bs-0049R)、羊抗兔SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒，均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 Olympus光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；離心機(jī)TDL-5-A(上海安亭科學(xué)儀器有限公司)；電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；電熱恒溫水箱600型(天津泰斯特儀器有限公司)；全自動(dòng)洗板機(jī)(美國伯騰儀器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 分組 采用隨機(jī)數(shù)字表將50只Wistar大鼠分成5組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、模型組、美沙拉嗪組及化濁解毒方高、低劑量組。

1.5.2 建模 采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇法[4]，將5%TNBS與50%乙醇等體積比例混合，配置成含TNBS 25 mg/mL的混合液，作為造模劑。大鼠禁食24 h后乙醚麻醉，石蠟油將直徑2 mm的硅膠管潤滑，插入倒置大鼠腸道約7～8 cm，正常對(duì)照組大鼠給予生理鹽水約0.8 mL，造模大鼠給予造模劑，劑量100 mg/kg(即4 mL/kg)，垂直倒置大鼠約30 s，造模完畢恢復(fù)正常進(jìn)食飲水。造模后第2天，模型組、美沙拉嗪組、化濁解毒方高劑量組大鼠各死亡1只。隨機(jī)抽取造模大鼠2只，斷頭處死，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織出現(xiàn)不同程度的充血水腫，有糜爛以及潰瘍形成，提示本次實(shí)驗(yàn)造模成功[5]。

1.5.3 給藥 正常對(duì)照組、模型組大鼠給予10 mL/kg生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d；化濁解毒方高、低劑量組給藥劑量分別為41.6、20.8 g/kg，按照10 mL/kg劑量給藥，每天1次，連續(xù)14 d；美沙拉嗪組給藥劑量0.3 g/kg，連續(xù)14 d。

1.5.4 指標(biāo)測(cè)定

1.5.4.1 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分 造模之日起，每天觀察大鼠精神、毛發(fā)、體質(zhì)量、糞便、飲食情況，并詳細(xì)記錄，參照Murano等[6]制定的DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。具體公式為DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3。

1.5.4.2 組織病理學(xué)變化 給藥后所有大鼠斷頭處死，在嚴(yán)格無菌條件下取出結(jié)腸組織，固定24 h后制作石蠟切片，HE染色，在顯微鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織的情況。

1.5.4.3 結(jié)腸黏膜Bax、caspase-9蛋白表達(dá) 大鼠結(jié)腸組織切塊，4%多聚甲醛固定，包埋切片，免疫組化檢測(cè)Bax、caspase-9表達(dá)[7]，石蠟切片，脫蠟脫水，3% H2O2室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，共2次，5%～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min，滴加一抗工作液，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過夜，5 min PBS 沖洗3次，二抗37 ℃孵育10～30 min，滴加適量辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育10～30 min，顯色劑顯色3～15 min，沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片后在顯微鏡下觀察。采用數(shù)碼顯微鏡和圖像采集系統(tǒng)觀察并照相，光鏡下陽性反應(yīng)為黃到棕黃色顆粒, 主要定位于胞漿, 亦可見于胞膜和核膜，應(yīng)用Image pro-Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定其積分光密度。

2 結(jié)果

2.1 大鼠DAI評(píng)分 與模型組比較，各藥物治療組DAI評(píng)分均降低(P<0.05)；化濁解毒方高劑量組DAI評(píng)分比低劑量組低(P<0.05)；化濁解毒方高劑量組DAI評(píng)分與美沙拉嗪組比較，無明顯變化(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠DAI評(píng)分

2.2 大鼠結(jié)腸病理學(xué)變化 正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜光滑，腺體結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，無充血、水腫、糜爛或潰瘍；模型組大鼠結(jié)腸黏膜充血、水腫明顯，可見多發(fā)糜爛、潰瘍?cè)钚纬?，鏡下腺體排列不規(guī)則、紊亂，杯狀細(xì)胞減少，周圍大量炎性細(xì)胞浸潤；化濁解毒方高劑量組、美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸黏膜基本光滑，充血、水腫減輕，潰瘍較少并可見已愈合的潰瘍面，腺體結(jié)構(gòu)基本完整，炎性細(xì)胞也明顯減少；化濁解毒方低劑量組大鼠結(jié)腸黏膜表面欠光滑，結(jié)腸組織輕度充血、水腫，可見少量糜爛、潰瘍，腺體結(jié)構(gòu)少量被破壞，部分邊緣覆少量新生腺體，見圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理變化(×100)

2.3 對(duì)大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)的影響 正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Bax呈弱陽性表達(dá)；與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，化濁解毒方高低劑量組、美沙拉嗪組Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)

2.4 對(duì)大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞caspase 9表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的caspase 9表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，化濁解毒方組、美沙拉嗪組caspase 9表達(dá)降低(P<0.05)，其中高劑量組低于低劑量組(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞caspase 9表達(dá)

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，認(rèn)為是感染、精神、遺傳、免疫等多種因素綜合作用的結(jié)果[8]。同時(shí)研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與上皮細(xì)胞破壞和凋亡有著密切關(guān)系[9-11]。細(xì)胞凋亡是一種重要的生物學(xué)過程，是在基因調(diào)控下所發(fā)生的一系列細(xì)胞主動(dòng)死亡過程[12]。當(dāng)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生時(shí)，結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖與凋亡平衡失調(diào)、凋亡過度，結(jié)腸上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的失去協(xié)調(diào)作用，進(jìn)而破壞上皮細(xì)胞屏障，引起物理性、化學(xué)性損傷，進(jìn)而形成潰瘍，如果上皮細(xì)胞脫落過快，潰瘍將難以愈合[11]。抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的過度凋亡，促進(jìn)受損黏膜的修復(fù)、愈合是潰瘍性結(jié)腸炎治療思路。Bax基因是人體最主要的凋亡基因，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。Bax促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)，進(jìn)而與Apaf-1及激活的caspase-9形成凋亡小體，從而激活caspase-3及后續(xù)線粒體凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。研究顯示caspase-9在細(xì)胞過度表達(dá)，凋亡率明顯增高[14]。

對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎病機(jī)認(rèn)識(shí)，中醫(yī)藥治療中提出“濁毒致病論”，認(rèn)為是因飲食內(nèi)傷、情志不舒，導(dǎo)致肝胃不和、胃氣失和、通降失職、清陽不升、濁邪內(nèi)停，日久則脾失健運(yùn)，水濕不化，濕濁中阻，郁滯不通，蘊(yùn)久化熱，熱壅血瘀而成毒，濁毒聚于腸腑，氣血瘀滯，血敗肉腐，傷及腸壁血絡(luò)，則會(huì)出現(xiàn)黏液膿血便、腹瀉、腹痛等[15]。潰瘍性結(jié)腸炎病機(jī)在于濁毒內(nèi)蘊(yùn)?；瘽峤舛痉接砂最^翁湯、香連丸、當(dāng)歸芍藥散等加減組合而成。結(jié)果顯示，化濁解毒方可降低UC大鼠DAI評(píng)分，改善結(jié)腸組織病理形態(tài)。與空白組比較，模型組大鼠Bax、caspase 9蛋白的表達(dá)增高，經(jīng)治療后各藥物治療組Bax、caspase 9蛋白的表達(dá)均降低，其中化濁解毒方降低最為明顯，與美沙拉嗪組效果相當(dāng)。提示化濁解毒方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)理可能是下調(diào)Bax、caspase 9蛋白的表達(dá)，抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的過度凋亡，促進(jìn)損傷結(jié)腸黏膜的修復(fù)，進(jìn)一步促進(jìn)潰瘍面的愈合。因此，化濁解毒法治療潰瘍性結(jié)腸炎具有廣闊的應(yīng)用前景，應(yīng)進(jìn)一步挖掘其維持腸黏膜屏障穩(wěn)態(tài)的深層作用機(jī)制。