楊 洋， 劉佳佳， 薛建華， 虞俊波

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院急診外科，江蘇 南通 226001)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)屬于慢性自身免疫疾病，其以骨侵蝕和慢性滑膜炎為主要病理特征，臨床上表現(xiàn)為小關(guān)節(jié)畸形、腫脹、疼痛，嚴重者可導(dǎo)致殘疾[1]?；こ衫w維細胞是RA發(fā)生的核心細胞，其與正常的滑膜成纖維細胞比較，具有過度增殖、凋亡減少以及分泌大量的炎癥因子等特點[2]。去甲斑蝥素屬于斑蝥素的衍生物，其是由呋喃和馬來酸酐按照Diel-Alder加成反應(yīng)而合成的，去甲斑蝥素具有明顯的抗腫瘤活性，能夠誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生[3]。研究報道顯示，去甲斑蝥素治療后的RA大鼠關(guān)節(jié)炎評分得到明顯改善，去甲斑蝥素具有保護RA的功效[4]。在腫瘤細胞的研究報道顯示，去甲斑蝥素作用機制與NF-κB有關(guān)，其可以通過下調(diào)NF-κB信號的激活水平發(fā)揮誘導(dǎo)細胞凋亡的作用[5]。NF-κB激活后可以誘導(dǎo)細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，NF-κB信號在RA滑膜成纖維細胞過度激活[6]。目前對于去甲斑蝥素對RA滑膜成纖維細胞凋亡和炎癥因子釋放的作用還不清楚。本次實驗探討去甲斑蝥素處理對人RA滑膜成纖維細胞凋亡和炎癥因子分泌的影響和機制，為RA的治療提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2018年10月于南通大學(xué)附屬醫(yī)院行關(guān)節(jié)置換術(shù)、滑膜切除術(shù)RA患者的滑膜組織，患者及其家屬知情同意。去甲斑蝥素(純度≥98%，上海伊奧生物科技有限公司)，RPMI1640溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。NF-κB p65抗體(上海時代生物科技有限公司)；白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)測定試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?；κB抑制蛋白激酶α(IκB kinaseα,IKK-α)抗體(上海研晶生物技術(shù)有限公司)；B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗體(青島捷世康生物科技有限公司)；Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)；Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, Bax)抗體(上海澤葉生物科技有限公司)；白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)測定試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司)。

1.2 RA滑膜成纖維細胞分離培養(yǎng)和分組 取滑膜組織，放在PBS中反復(fù)洗滌3次，小心將滑膜組織中的脂肪、軟骨組織、骨片清除干凈，用眼科剪將滑膜組織剪碎后放在培養(yǎng)瓶中，添加4 mg/mL Ⅱ型膠原酶，置于37 ℃搖床中孵育振蕩反應(yīng)4 h，100目濾網(wǎng)過濾消化液，離心10 min，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細胞融合以后用胰蛋白酶消化傳代[7]，取第4代細胞用于后續(xù)實驗。RA滑膜成纖維細胞分為對照組、去甲斑蝥素組，在細胞增殖檢測過程中去甲斑蝥素組又分為4個質(zhì)量濃度，分別為5、10、20、40 μg/mL，其余實驗選用20 μg/mL。

1.3 MTT法 將RA滑膜成纖維細胞密度調(diào)整到4×105/mL，取100 μL種植到96孔板上，按“1.2”項下方法分離培養(yǎng)和分組，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，添加MTT溶液10 μL，繼續(xù)放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，將孔內(nèi)上清棄掉，添加150 μL DMSO溶液，孵育10 min，酶標(biāo)儀檢測光密度(OD)值。

1.4 流式細胞術(shù) 收集已經(jīng)培養(yǎng)24 h后的對照組、去甲斑蝥素組細胞，胰蛋白酶消化，添加PBS緩沖液至細胞，離心10 min。加入400 μL Binding Buffer充分混合，移液器吸棄5 μL Annexin V-FITC、PI溶液至細胞，用流式細胞儀檢測前添加100 μL Binding Buffer混勻。

1.5 Western blot法 收集培養(yǎng)24 h的對照組、去甲斑蝥素組細胞，PBS洗滌2次，添加RIPA蛋白抽提試劑，細胞培養(yǎng)板放在冰上孵育30 min，將細胞裂解液轉(zhuǎn)移到離心管中，在4 ℃下離心10 min，吸取蛋白上清分裝至EP管中保存，蛋白樣品在上樣前與Loading Buffer混合煮沸5 min，SDS-PAGE凝膠電泳每孔蛋白上樣量為30 μg，以12%分離膠、5%濃縮膠進行電泳，SDS-PAGE電泳電壓設(shè)置為恒壓100 V，取出分離膠，在90 V、4 ℃下轉(zhuǎn)膜40 min，取出轉(zhuǎn)膜后的NC膜，放在含有封閉液的平皿內(nèi)，在室溫環(huán)境中結(jié)合反應(yīng)1 h，然后將NC膜取出，以TBST溶液洗3次，放在含有一抗稀釋液的平皿內(nèi)，在4 ℃環(huán)境中結(jié)合反應(yīng)過夜，TBST洗滌，NC膜放在含有二抗稀釋液的平皿內(nèi)，在室溫下反應(yīng)1 h，ECL法顯色，內(nèi)參為β-actin。根據(jù)條帶的灰度值，分析目的蛋白Bax、Bcl-2、IKK-α、NF-κB p65表達量。

1.6 ELISA法 收集培養(yǎng)24 h的對照組、去甲斑蝥素組細胞培養(yǎng)液上清，ELISA法檢測IL-6、IL-8水平，按照相關(guān)檢測試劑盒說明書進行。

1.7 NF-κB信號激活劑對去甲斑蝥素的影響檢測 RA滑膜成纖維細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，同時添加含有20 μg/mL去甲斑蝥素、1 μmol/L NF-κB信號激活劑佛波醇脂的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為去甲斑蝥素+佛波醇脂組，以去甲斑蝥素組(按“1.2”項下方法處理)為對照，檢測細胞凋亡，Bax、Bcl-2、IKK-α、NF-κB p65蛋白表達及IL-6、IL-8水平。

2 結(jié)果

2.1 去甲斑蝥素對RA滑膜成纖維細胞增殖影響 經(jīng)5、10、20、40 μg/mL去甲斑蝥素處理后，RA滑膜成纖維細胞增殖能力降低(P<0.01)，在20 μg/mL下抑制率接近50%，故后續(xù)選用該質(zhì)量濃度進行實驗，見表1。

表1 各組RA滑膜成纖維細胞OD值

2.2 去甲斑蝥素對RA滑膜成纖維細胞凋亡影響 去甲斑蝥素處理后，RA滑膜成纖維細胞凋亡率升高(P<0.01)，細胞Bax蛋白表達增加(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達減少(P<0.01)，見圖1、表2。

注：A為細胞凋亡，B為Bcl-2、Bax蛋白表達。

表2 各組RA滑膜成纖維細胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表達

2.3 去甲斑蝥素對RA滑膜成纖維細胞IL-6、IL-8水平的影響 去甲斑蝥素處理后，RA滑膜成纖維細胞IL-6、IL-8水平減少(P<0.01)，見表3。

表3 各組RA滑膜成纖維細胞IL-6、IL-8水平

2.4 去甲斑蝥素對RA滑膜成纖維細胞NF-κB信號通路激活的影響 去甲斑蝥素處理后，RA滑膜成纖維細胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表達下降(P<0.01)，見圖2、表4。

表4 各組RA滑膜成纖維細胞IKK-α、NF-κB p65蛋白

圖2 各組RA滑膜成纖維細胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表達

2.5 NF-κB信號激活劑對去甲斑蝥素影響RA滑膜成纖維細胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表達的干預(yù)作用 與未經(jīng)NF-κB信號激活劑處理比較，NF-κB信號激活劑與去甲斑蝥素共同處理后RA滑膜成纖維細胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表達升高(P<0.01)，見圖3、表5。

表5 共同處理后各組RA滑膜成纖維細胞IKK-α、NF-κB p65蛋白

圖3 共同處理后各組RA滑膜成纖維細胞IKK-α、NF-κB p65蛋白表達

2.6 NF-κB信號激活劑對去甲斑蝥素影響RA滑膜成纖維細胞凋亡及IL-6、IL-8水平的干預(yù)作用 與未經(jīng)NF-κB信號激活劑處理比較，NF-κB信號激活劑與去甲斑蝥素共同處理后RA滑膜成纖維細胞凋亡率降低(P<0.01)，Bax蛋白表達減少(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達升高(P<0.01)，IL-6、IL-8水平增加(P<0.01)，見圖4、表6。

注：A為細胞凋亡，B為Bcl-2、Bax蛋白表達。

表6 共同處理后各組RA滑膜成纖維細胞凋亡率，Bcl-2、Bax蛋白及IL-6、IL-8水平

3 討論

RA是由多種因素誘發(fā)而形成的，RA發(fā)生時，滑膜組織中巨噬細胞、CD4+T細胞以及B細胞浸潤導(dǎo)致滑膜內(nèi)層增生，而滑膜成纖維細胞是滑膜內(nèi)層的主要組成部分[8]。RA滑膜成纖維細胞過度增殖、凋亡減少，同時能夠分泌大量的炎癥因子，促進關(guān)節(jié)功能喪失和破壞[9]。IL-6、IL-8是常見的RA滑膜成纖維細胞分泌的炎癥因子，二者可以誘導(dǎo)組織炎癥發(fā)生[10]。Bax和Bcl-2分別為促細胞凋亡和抗細胞凋亡蛋白，其表達的高低與細胞凋亡密切相關(guān)[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素處理后的RA滑膜成纖維細胞增殖能力下降，細胞凋亡水平增加，細胞分泌的IL-6、IL-8減少，說明去甲斑蝥素具有誘導(dǎo)RA滑膜成纖維細胞凋亡和抑制炎癥因子分泌的作用。

去甲斑蝥素是我國研發(fā)的抗腫瘤藥物，其可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[12]。另外，去甲斑蝥素還具有改善缺血性心臟病、狼瘡性腎炎、腎炎等功效[13-15]。研究顯示去甲斑蝥素具有保護RA的作用[4]。本實驗證實去甲斑蝥素抗RA機制與誘導(dǎo)滑膜成纖維細胞凋亡和抑制炎癥因子分泌有關(guān)，提示去甲斑蝥素具有明確的抗RA功效。

目前對于去甲斑蝥素在疾病治療中的作用機制還不明確，已知其可以通過調(diào)控下游復(fù)雜的信號通路或蛋白表達而發(fā)揮作用[16]。去甲斑蝥素通過抑制多發(fā)性骨髓瘤、白血病等細胞NF-κB信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用[17-18]。在超負荷腎病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素能夠抑制NF-κBp65蛋白表達[19]。NF-κB是一個廣泛參與細胞正常生理和疾病發(fā)生過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，NF-κB參與人類自身免疫疾病發(fā)生，與細胞凋亡、增殖和炎癥反應(yīng)有關(guān)[20]。NF-κB在靜息狀態(tài)下以復(fù)合物的形式存在，而外界信號刺激后可以誘導(dǎo)IKK激活而促進NF-κB同靶基因的結(jié)合，從而促進靶基因的表達[21]。IKK-α是IKK催化亞基，其表達增多是NF-κB信號通路激活的啟動步驟[22]。NF-κB p65是NF-κB的亞單位，也是NF-κB發(fā)揮生物學(xué)作用的必需分子[23]。本實驗顯示，去甲斑蝥素處理后的RA滑膜成纖維細胞IKK-α、NF-κB p65表達下降，并且NF-κB信號激活劑可以逆轉(zhuǎn)去甲斑蝥素對RA滑膜成纖維細胞凋亡促進和炎癥因子分泌的抑制作用，證實去甲斑蝥素作用機制與下調(diào)NF-κB信號有關(guān)。

去甲斑蝥素具有促進RA滑膜成纖維細胞凋亡和抑制細胞分泌炎癥因子的作用，其機制與下調(diào)NF-κB信號通路激活水平有關(guān)。這為研究去甲斑蝥素在RA中的作用提供了參考。