王秋靜， 王濼瓔， 王 蘋， 楊 麗

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130021；4.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院人獸共患病研究所，吉林 長春 130062)

心肌缺血再灌注(repefusion injury, I/R)損傷是心臟缺血性疾病、心臟手術(shù)和器官移植中常見的一種病理性損傷，是影響心功能恢復(fù)的重要因素[1]。紅景天為景天科景天屬多年生草本植物或亞灌本植物，主要生長于高寒、缺氧地區(qū)，因此具有極強(qiáng)的抗氧化作用。紅景天主要有效成分有紅景天苷、紅景天素、酪醇等，其中紅景天苷可以從植物的根、莖中提取[2]，近年來的研究表明，紅景天苷不僅具有抗缺氧、抗疲勞等功效，而且在抗心肌缺血，補(bǔ)氣養(yǎng)血活血等方面都具有較好的調(diào)節(jié)和補(bǔ)益作用[3]，本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法復(fù)制心肌I/R模型，在整體動(dòng)物模型基礎(chǔ)上研究觀察紅景天苷對(duì)I/R心肌的影響，探討其保護(hù)作用機(jī)制，為紅景天苷用于心肌保護(hù)提供新的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量220～240 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(吉)2016-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)和處理嚴(yán)格遵循動(dòng)物福利3R原則和吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)相關(guān)條例要求。

1.2 試劑與藥物 紅景天苷購于北京索萊寶科技有限公司(SS8080，純度≥98%)。生脈注射液，華西醫(yī)科大學(xué)制藥廠，批號(hào)050416；戊巴比妥鈉，北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)060222。2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，上?；菔郎噭┯邢薰?，批號(hào)100708；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(批號(hào)20180822、20180115、20180415、20181008)，南京建成生物工程研究所；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號(hào)181371、180961、190671)，中生北控生物科技股份有限公司；caspase-3、Bradford試劑盒(貨號(hào)C1168S、P0006C)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒(貨號(hào)G3250)，美國Promega公司。

1.3 儀器 Powerlab15T生物機(jī)能數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，埃德儀器國際貿(mào)易(上海)有限公司；DW-3000A/B小動(dòng)物呼吸機(jī)，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；UV755B紫外-可見分光光度計(jì)，上海分析儀器總廠；ELX808酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器公司；DT5-3離心機(jī),北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；EOS880半自動(dòng)生化分析儀，意大利CGA strumenti scientific S.P.A公司。

2 方法

2.1 分組 Wistar大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組，模型組，陽性藥組，紅景天苷低、中、高劑量組，每組20只，假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水2 mL/kg，陽性藥組給予450 mg/kg生脈注射液，紅景天苷低、中、高劑量組分別給予7.5、15、30 mg/kg紅景天苷，各組均連續(xù)腹腔注射給藥7 d。

2.2 模型建立 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，麻醉、固定后記錄正常心電圖，胸部去毛，醫(yī)用酒精消毒皮膚，荷包穿線，無創(chuàng)性氣管插管，自左側(cè)3～4肋間開胸，剪開心包，輕壓右側(cè)胸廓暴露心臟，迅速穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(假手術(shù)組鼠只穿線不結(jié)扎)，將心臟送回胸腔內(nèi)，擠出胸腔內(nèi)空氣快速關(guān)閉胸腔。觀察心電變化，以ST段抬高或下降0.2 mV為造模成功標(biāo)志，缺血60 min后開胸，松解縫合線實(shí)現(xiàn)血流再灌，荷包縫合，再灌注24 h后取材檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

2.3 大鼠血清AST、CK、LDH、SOD、NOS活性和MDA、NO水平測(cè)定 大鼠再灌注24 h后腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，按相關(guān)試劑盒說明書步驟檢測(cè)AST、CK、LDH、SOD、MDA、NO、NOS。

2.4 大鼠心肌組織caspase-3活性測(cè)定 取大鼠心臟左心室前壁組織，置于-80 ℃冰箱中保存，制備勻漿時(shí)將其取出，在冰上切成約20～30 mg的組織塊，剪碎，加入300 μL裂解液，冰上勻漿，置于1.5 mL的EP管中，冰浴裂解5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將上清液移入預(yù)冷的EP管內(nèi)，按相關(guān)試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，采用分光光度法檢測(cè)caspase-3活性。同時(shí)取少量樣本，采用Bradford蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算caspase-3的酶活力單位(單位質(zhì)量蛋白中的酶活力單位)。

2.5 大鼠心肌梗死面積測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束摘取大鼠心臟，剪去主動(dòng)脈弓、右心室、心房、心耳等，將左心室切割為5份，每份厚1 mm左右，染色孵育10 min(37 ℃、1% TTC溶液)，染色后先放入5%福爾馬林中(防止染色后的心肌暴露在空氣中因氧化導(dǎo)致顏色加深)，然后將染色的心肌切片放入盛有蒸餾水的特定器皿中(使染色后的心肌切片保持清晰、色彩鮮艷)并進(jìn)行拍照，正常心肌為紅色，梗死區(qū)域?yàn)榛野咨?。?yīng)用BI-2000圖像分析系統(tǒng)測(cè)量心肌梗死面積，心肌梗死面積=(每片切片梗死心肌面積之和/整個(gè)左心室面積)×100%。

2.6 大鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取大鼠心臟左心室前壁組織，置于10%福爾馬林中固定，石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后，按照TUNEL試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。采用微計(jì)處理系統(tǒng)，在缺血區(qū)邊緣隨機(jī)采集5個(gè)非重疊視野，檢測(cè)心肌細(xì)胞中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，并取其平均值，凋亡指數(shù)=(單位面積內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

2.7 蛋白印跡檢測(cè) 取大鼠心臟左心室組織，眼科剪剪碎，加入細(xì)胞裂解液，超聲破碎細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA法蛋白定量，每孔上樣30 μg/20 μL，樣本與5×上樣緩沖液混勻后95 ℃變性10 min，將樣本置于10% SDS-PAGE中，在120 V下電泳2.5 h，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，取出轉(zhuǎn)移后的PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(Nrf2，1∶1 000稀釋；ERK，1∶1 000稀釋；p-ERK，1∶500稀釋；β-actin，1∶5 000稀釋)，在4 ℃下孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次15 min，加入二抗，稀釋倍數(shù)為1∶2 000，孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光底物, 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)蛋白表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件對(duì)圖像中條帶的灰度值進(jìn)行相對(duì)定量分析。

3 結(jié)果

3.1 紅景天苷對(duì)大鼠血清AST、CK、LDH、SOD活性和MDA水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清AST、CK、LDH活性和MDA水平升高(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組和紅景天苷中、高劑量組大鼠血清AST、CK、LDH活性和MDA水平均降低(P<0.05，P<0.01)，SOD活性增加(P<0.01)，見表1。

表1 紅景天苷對(duì)大鼠血清AST、CK、LDH、SOD活性和MDA水平的影響

3.2 紅景天苷對(duì)大鼠血清NO水平、NOS活性及心肌組織caspase-3活性的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清NO水平、NOS活性降低(P<0.01)，caspase-3活性增加(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組和紅景天苷中、高劑量組大鼠血清NO水平和NOS活性均升高(P<0.05，P<0.01)，caspase-3活性降低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 紅景天苷對(duì)大鼠血清NO水平、NOS活性及心肌組織caspase-3活性的影響

3.3 紅景天苷對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響 假手術(shù)組大鼠心肌沒有明顯的梗死；模型組大鼠心肌梗死面積為(46.89±5.81)%；經(jīng)紅景天苷處理后，梗死面積與低于模型組，以中、高劑量組更明顯(P<0.01),見圖1、表3。

注：A為心肌切片TTC染色，B為心梗面積定量分析。與模型組比較，**P<0.01。

表3 紅景天苷對(duì)大鼠心肌梗死面積、細(xì)胞凋亡的影響

3.4 紅景天苷對(duì)大鼠細(xì)胞凋亡的影響 如圖2所示，假手術(shù)組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)<3.45%，模型組達(dá)(34.34±5.83)%，陽性藥組降至(12.00±2.68)%；與模型組比較，紅景天苷各劑量組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)均降低(P<0.05，P<0.01)，其中中、高劑量組分別為(18.53±3.01)%、(12.88±2.94)%，見表3。

注：A為心肌組織TUNEL熒光染色圖(×400)，B為心肌組織細(xì)胞凋亡定量分析統(tǒng)計(jì)圖。紅色熒光為PI染色細(xì)胞核，綠色熒光為凋亡陽性細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.5 紅景天苷對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Nrf2、ERK蛋白表達(dá)的影響 圖3顯示，模型組大鼠心肌組織Nrf2蛋白表達(dá)降低，而紅景天苷處理后可提高其表達(dá)(P<0.01)，以中、高劑量組更明顯；模型組大鼠p-ERK蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組(P<0.01)，而紅景天苷處理后能提高ERK磷酸化水平(P<0.01)。

注：A為大鼠心肌組織蛋白印跡圖，B～C分別為大鼠心肌組織Nrf2、ERK蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

4 討論

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，紅景天具有保護(hù)心肌作用，紅景天苷是其主要有效成分，本實(shí)驗(yàn)研究也表明紅景天苷預(yù)處理后，可有效保護(hù)缺血再灌注損傷大鼠的心肌組織。

CK、LDH及AST廣泛存在于細(xì)胞胞漿中，急性心肌缺血，可導(dǎo)致心肌組織細(xì)胞損傷，細(xì)胞生物膜通透性增高，引起細(xì)胞胞漿CK、LDH及AST三種重要心肌酶的釋放增加[4]。心肌再灌注時(shí)，氧自由基(ROS)進(jìn)一步堆積引起脂質(zhì)過氧化，直接參與組織細(xì)胞損傷，使CK、LDH等大量漏出，這樣血中的心肌酶就會(huì)升高，胞漿酶釋放量增加可反應(yīng)細(xì)胞損傷嚴(yán)重[5]，MDA為ROS與細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，常被作為反映ROS生成和造成膜損害的指標(biāo)；SOD是心肌清除氧自由基所必須的酶，其活性反應(yīng)I/R心肌抗氧化作用程度[6]。ROS的代謝紊亂是I/R的病理生理機(jī)制之一[7]。心肌缺血時(shí)，SOD活性下降，脂質(zhì)過氧化物MDA等水平升高，對(duì)心肌細(xì)胞造成不可逆損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可減少CK、LDH、AST釋放及MDA水平，增加SOD活性，提示紅景天苷對(duì)心肌細(xì)胞膜有保護(hù)作用。

NO是內(nèi)皮細(xì)胞依賴的舒血管因子，在心血管、神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌等方面起到重要調(diào)節(jié)作用。NOS是內(nèi)皮細(xì)胞中重要的功能蛋白，活化的NOS催化L-精氨酸產(chǎn)生NO，后者作為重要的第二信使激活復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮其舒張血管、抗細(xì)胞增殖及抗動(dòng)脈粥樣硬化等心血管保護(hù)作用[8]。本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法復(fù)制心肌I/R模型造成心肌缺血缺氧，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，釋放大量內(nèi)皮素，抑制NOS的活性，使NO生成減少，出現(xiàn)心肌梗死病理損傷。此外，NO還可以通過影響缺血再灌注過程中的炎癥反應(yīng)過程，使心肌細(xì)胞壞死和凋亡減少[9]。

近年來研究表明[10-11]，細(xì)胞凋亡是I/R導(dǎo)致心肌損傷、心肌細(xì)胞丟失的重要病理機(jī)制之一，被認(rèn)為是心臟由代償性變化向病理性變化發(fā)展的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。缺血和再灌注如果持續(xù)性出現(xiàn)可使不可逆性細(xì)胞凋亡加速發(fā)生[12]。胞漿中的ROS和鈣離子作為細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要信使分子可直接激活caspase級(jí)聯(lián)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]，caspase-3又被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶，是凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能降低caspase-3活性，減少細(xì)胞凋亡。

紅景天苷具有抗氧化應(yīng)激作用已在多種組織中被證實(shí)[15-16],調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子是核因子-E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)。紅景天苷上調(diào)Nrf2信號(hào)，活化后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，調(diào)控包括細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)和解毒酶表達(dá)發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[17]。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)屬于絲裂原活化蛋白激酶通路，可被ROS啟動(dòng)，通過分子磷酸化激活下游的Nrf2參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和凋亡等多種生物學(xué)反應(yīng)[18]。實(shí)驗(yàn)通過蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)紅景天苷對(duì)大鼠缺血再灌過程心肌組織Nrf2和ERK表達(dá)的影響。證實(shí)了Nrf2和ERK磷酸化在心肌缺血再灌損傷的心肌組織中表達(dá)下降。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還提示紅景天苷對(duì)心肌I/R的保護(hù)作用通過激活Nrf2和促進(jìn)ERK蛋白磷酸化實(shí)現(xiàn)的。但Nrf2表達(dá)與ERK磷酸化水平不同步，推測(cè)紅景天苷對(duì)心肌的保護(hù)可能是兩條獨(dú)立信號(hào)通路聯(lián)合作用的結(jié)果，ERK并非作為Nrf2的上游信號(hào)調(diào)控紅景天苷的心肌保護(hù)，可能還存在其他調(diào)控信號(hào)途徑。

綜上所述，本課題證實(shí)了紅景天苷可減少CK、LDH、AST釋放和MDA水平，紅景天苷可增加I/R模型大鼠血清SOD、NOS的活性和NO水平；在心肌組織中通過降低caspase-3活性，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而使I/R引起的心肌組織損傷得以改善。進(jìn)一步的研究表明，紅景天苷保護(hù)I/R模型大鼠心肌組織可能是通過激活Nrf2和ERK信號(hào)通路。本課題組將對(duì)紅景天苷的具體保護(hù)機(jī)制作深入探討和研究，為紅景天苷的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。