劉小妹， 楊媛媛， 胡 靜， 任 慧， 崔小敏， 李 寧， 曲 彤， 陶宏迅，陳志永*

(1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050；3.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710054；4.澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院，澳門 999078)

馮了性風(fēng)濕跌打藥酒是具有400余年歷史的傳世名方，2020年版《中國藥典》(一部)收載該藥由丁公藤、麻黃、桂枝等27味中藥組成[1-2]。該方中丁公藤祛風(fēng)濕為主藥，配以桂枝、麻黃、羌活等發(fā)散風(fēng)寒；香附、木香、厚樸等行氣燥濕；小茴香、當(dāng)歸、川芎等溫經(jīng)活血；白術(shù)、山藥、補(bǔ)骨脂等補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝。臨床上主要用于治療風(fēng)寒濕痹、跌撲損傷等癥[2-3]。

大果飛蛾藤PoranasinensisHemsl為旋花科飛蛾藤屬植物，在我國主要分布于廣西、貴州、云南、湖北、廣東等地[4]。2020年版《中國藥典》規(guī)定中藥丁公藤為旋花科丁公藤屬植物丁公藤ErycibeobtusifoliaBenth或光葉丁公藤ErycibeschmidtiiCraib的干燥藤莖，是我國傳統(tǒng)民間用藥，具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛的功效，是馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的君藥。近年來，由于生態(tài)環(huán)境惡化和過度采挖導(dǎo)致丁公藤、光葉丁公藤野生藥用資源急劇減少，大果飛蛾藤已逐漸成為丁公藤的主流替代品種[5]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)大果飛蛾藤與丁公藤藥材化學(xué)成分高度相似，且具有相近的抗炎、鎮(zhèn)痛藥效，具有作為丁公藤替代品使用的潛力[6]。然而，大果飛蛾藤是否能夠作為丁公藤替代品使用尚需開展更加系統(tǒng)深入的研究。開展使用丁公藤和大果飛蛾藤投料制備的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的快速鑒別，以及不同投料對抗風(fēng)濕藥效的影響研究，對于該藥酒的臨床有效性、安全性應(yīng)用意義重大。

本研究采用HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別的方法，發(fā)掘出以丁公藤、大果飛蛾藤投料的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的3種差異性成分和1種專屬性成分，并采用限定成分間峰面積比值的方法實(shí)現(xiàn)了不同投料藥酒的快速鑒別。同時(shí)，對差異性成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，以期闡明丁公藤、大果飛蛾藤投料對藥酒抗風(fēng)濕藥效的影響。研究結(jié)果顯著提升了馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的質(zhì)量控制水平，為其臨床應(yīng)用提供保障。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260型高效液相色譜儀，包括G7114A紫外檢測器、G7129A自動(dòng)進(jìn)樣器、G7111A四元泵、OpenLAB CDS色譜工作站(美國安捷倫公司)；KQ-100型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；BT25S、Max21g型電子分析天平(十萬分之一，美國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 鹽酸麻黃堿(批號171241-201809，純度≥98%)、鹽酸偽麻黃堿(批號171237-201510，純度≥98%)均購自中國食品藥品檢定研究院；東莨菪苷(批號16040805)、東莨菪內(nèi)酯(批號161208)、綠原酸(批號1701904)、隱綠原酸(批號17061401)、新綠原酸(批號17062003)、異綠原酸A(批號18090301)、異綠原酸B(批號17121201)、異綠原酸C(批號18070401)均購自上海圻明生物科技有限公司，純度均不低于98%；桂皮醛(批號wkq19031207，純度≥98%)購自四川維克奇生物有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。4批丁公藤藥材，5批大果飛蛾藤樣品，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院陳志永副研究員鑒定分別為旋花科植物丁公藤ErycibeobtusifoliaBenth.或光葉丁公藤ErycibeschmidtiiCraib的干燥藤莖，旋花科飛蛾藤屬植物大果飛蛾藤PoranasinensisHemsl.的干燥藤莖。信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 參照2020年版《中國藥典》相關(guān)要求，分別以丁公藤、大果飛蛾藤投料制備馮了性風(fēng)濕跌打藥酒[2]。9批馮了性風(fēng)濕跌打藥酒編號為S1～S9，丁公藤投料的藥酒編號記為S1～S4，大果飛蛾藤投料的藥酒編號記為S5～S9。精密量取上述各批馮了性風(fēng)濕跌打藥酒10 mL，置于20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 混合對照品溶液 精密稱取各對照品適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成含鹽酸麻黃堿0.247 5 mg/mL、鹽酸偽麻黃堿0.260 0 mg/mL、新綠原酸0.382 0 mg/mL、東莨菪苷0.390 0 mg/mL、綠原酸0.306 0 mg/mL、隱綠原酸0.476 0 mg/mL、東莨菪內(nèi)酯0.454 0 mg/mL、異綠原酸B 0.463 0 mg/mL、異綠原酸A 0.490 0 mg/mL、異綠原酸C 0.450 0 mg/mL、桂皮醛0.759 0 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～18 min，6% A；18～80 min，10%～25% A；80～110 min，25%～45% A；110～120 min，45%～70% A)；采用多波長切換模式(14～18 min，210 nm；18～80 min，345 nm；80～120 min，300 nm)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取藥酒(編號S1)適量，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。，以東莨菪內(nèi)酯(16號色譜峰)為參照峰，各共有色譜峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD均在3.0%以內(nèi)，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥酒(編號S1)適量，按“2.1”項(xiàng)下方法制備6份，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，以東莨菪內(nèi)酯(16號色譜峰)為參照峰，各共有色譜峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD均在3.0%以內(nèi)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取藥酒(編號S1)適量，分別于0、2、4、8、12、24 h在“2.2”項(xiàng)色譜條件下測定，以東莨菪內(nèi)酯(16號色譜峰)為參照峰，各共有色譜峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD均在3.0%以內(nèi)，表明該樣品在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜建立 取“2.1”項(xiàng)下S1～S9樣品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下測定，9批馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的HPLC色譜圖見圖1。將指紋圖譜信息以AIA(.cdf)格式全譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012年版)，以色譜峰保留時(shí)間在± 0.2 min內(nèi)且紫外吸收光譜一致為判別標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.5 min，系統(tǒng)經(jīng)多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配。S1～S9樣品中共檢出29個(gè)不同成分色譜峰，按保留時(shí)間順序依次編號為1～29，經(jīng)與對照品S0的圖譜比對，指認(rèn)了11個(gè)色譜峰，分別為鹽酸麻黃堿(7號峰)、鹽酸偽麻黃堿(8號峰)、東莨菪苷(12號峰)、東莨菪內(nèi)酯(16號峰)、綠原酸(13號峰)、隱綠原酸(14號峰)、新綠原酸(9號峰)、異綠原酸A(22號峰)、異綠原酸B(20號峰)、異綠原酸C(24號峰)、桂皮醛(26號峰)。

圖1 9批樣品HPLC指紋圖譜

2.5 差異性成分分析

2.5.1 直觀分析 從圖1中可見，不同投料的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒指紋圖譜存在一定差異，其差異分為組分專屬性差異和組分量的差異[7]。組分專屬性差異主要體現(xiàn)在2個(gè)位置，74.50 min處，樣品S5～S9檢測到色譜峰，峰面積分別為120.50、67.20、69.58、70.45、54.42，樣品S1～S4則未檢測到色譜峰；93.00 min處，樣品S5～S9檢出色譜峰，峰面積依次為522.97、251.90、395.50、345.88、256.41，樣品S1～S4則未檢出峰。組分量的差異主要體現(xiàn)在3個(gè)色譜峰位置，19.80 min(9號峰)、31.40 min(14號峰)、63.80 min(20號峰)，樣品S5～S9峰面積明顯高于樣品S1～S4。綜上所述，組分專屬性差異體現(xiàn)在2個(gè)位置，93.00 min處專屬性特征峰峰面積響應(yīng)較大，74.50 min處專屬峰響應(yīng)值較小，受基線影響可以忽略不計(jì)；組分量的差異方面，3個(gè)位置均表現(xiàn)出較大的組分量的差異。

2.5.2 PCA分析 PCA分析是對各樣品的峰面積原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，獲得能夠概括原始信息絕大部分的主成分及貢獻(xiàn)率[8-9]。將不同批馮了性風(fēng)濕跌打藥酒指紋圖譜信息進(jìn)行峰對齊、溶劑峰去除等處理后，將其峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入Markerlynx XS(Waters, Manchester, UK)軟件，進(jìn)行PCA分析，得到一個(gè)含有兩個(gè)主成分的模型，見圖2。不同投料的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒自動(dòng)分為兩組，PC1反映整體信息的39.4%，PC2反映整體信息的21.4%，這表明兩種藥酒成分具有一定差異。

圖2 9批樣品主成分分析圖

2.5.3 PLS-DA分析 PLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識別方法，具有直觀、清晰的分析效果及較高的預(yù)測精度和強(qiáng)大的解釋能力[10-11]，本研究引入PLS-DA來探討不同投料的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒在成分上的差異。將9批樣品29個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入Markerlynx XS分析軟件，啟動(dòng)PLS-DA分析程序，分別生成得分圖、變量重要性投影值圖(variable importance in projection, VIP)以及差異性成分的平均峰面積柱狀圖，見圖3～5。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，并按照樣品分類自動(dòng)著色。樣本經(jīng)分析得到兩個(gè)主成分的模型，模型的解釋度R2(Y)為98.8%，預(yù)測度Q2為89.6%，可以解釋變量的56.5%，這證明該模型解釋能力和預(yù)測能力良好。利用VIP分析可以發(fā)掘差異性變量，變量9、14、20的VIP值>1.5，表明變量對模型分類的貢獻(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對區(qū)分不同投料馮了性風(fēng)濕跌打藥酒作用較大。變量9、14、20分別歸屬為新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸B。

圖3 各樣品PLS-DA得分散點(diǎn)圖

圖4 各樣品VIP投影圖

圖5 3種差異性成分平均峰面積柱狀圖

2.6 鑒別方法 東莨菪內(nèi)酯為2020年版《中國藥典》中丁公藤藥材的質(zhì)控成分，且該成分在大果飛蛾藤中同樣含量較高。同時(shí)，東莨菪內(nèi)酯在本研究所建立的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒指紋圖譜中分離效果優(yōu)于其他成分。因此，本研究選擇東莨菪內(nèi)酯為參照物，計(jì)算3種差異性成分的峰面積與參照物峰面積的相對比值，結(jié)果見表2。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析中用樣本均數(shù)作為總體均數(shù)的點(diǎn)估計(jì)值，以均數(shù)加減2倍標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)據(jù)估計(jì)總體值(約為95%)，使絕大部分落在可信區(qū)間內(nèi)。以新綠原酸為例，可認(rèn)為其與東莨菪內(nèi)酯的峰面積比值落在(0.079±0.050)范圍內(nèi)是以丁公藤投料，比值在(0.765±0.546)范圍內(nèi)是以大果飛蛾藤投料。同樣，可認(rèn)為隱綠原酸與東莨菪內(nèi)酯峰面積比值落在(0.122±0.068)范圍內(nèi)是以丁公藤投料，在(0.888±0.560)范圍內(nèi)是以大果飛蛾藤投料。異綠原酸B與東莨菪內(nèi)酯峰面積比值落在(0.367±0.294)范圍內(nèi)是以丁公藤投料，在(1.894±1.866)范圍內(nèi)是以大果飛蛾藤投料。然而，大果飛蛾藤、丁公藤投料的藥酒中，異綠原酸B與東莨菪內(nèi)酯峰面積比值95%置信區(qū)間大部分重合，因此該項(xiàng)指標(biāo)無法用于不同投料的藥酒鑒別。綜上，新綠原酸與東莨菪內(nèi)酯峰面積比值，隱綠原酸與東莨菪內(nèi)酯峰面積比值可用于以丁公藤、大果飛蛾藤投料的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的鑒別，見表2。

表2 丁公藤、大果飛蛾藤投料的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒鑒別指標(biāo)

2.7 差異性成分網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究 對篩選得到的差異性成分借助TCMSP[12](https://tcmspw.com/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction[13](http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫，依據(jù)成分的2D結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線靶點(diǎn)預(yù)測，剔除評分值為0的預(yù)測靶標(biāo)，篩選得到活性成分相關(guān)的靶標(biāo)蛋白。新綠原酸的靶點(diǎn)蛋白有AKR1B1、AKR1B10、MMP13、MMP2、APP、MMP12、ELANE、SLC37A4、PYGL、PRKCD、PRKCA、NEU4、BACE1、PDE4D、PDE9A、PDE1B、ABCB1、PTPN22；隱綠原酸的靶點(diǎn)蛋白有NEU3、NEU2、MGLL；異綠原酸B的靶點(diǎn)蛋白有FYN、SELE、SELP、YARS、HCAR2、PTGDR2、CASP3、PIM1、FOLH1、CASP6、CASP7、CASP8、CASP1。再分別以“Rheumatoid Arthritis(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)”為檢索詞在Dragbank[14](https://www.drugbank.ca/)、OMIM[15](https://omim.org/)、GeneCards[16](https://www.genecards.org/)、TTD[17](http://db.idrblab.net/ttd/)、Disgenet[18](https://www.disgenet.org/)等在線數(shù)據(jù)庫檢索相應(yīng)的疾病靶點(diǎn)，根據(jù)不同數(shù)據(jù)庫的篩選條件，將篩選結(jié)果歸納合并，去除重復(fù)合并后得到2 842個(gè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)疾病靶標(biāo)蛋白。利用STRING平臺數(shù)據(jù)庫形成PPI(protein-protein interaction)關(guān)系，隱藏掉一些游離散在的靶點(diǎn)，采用Cytoscape 3.7.2軟件建立“Merged Network”網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)(DC值、BC值、CC值)提取得到Hub核心網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)度值的大小，按從大到小的排序列出排名前10的核心靶點(diǎn)，分別為CASP3、ELANE、MMP2、CASP8、SELP、MMP13、CASP1、MMP12、ABCB1、SELE。在該網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中，節(jié)點(diǎn)大小根據(jù)度值從小到大，節(jié)點(diǎn)由小到大；節(jié)點(diǎn)顏色根據(jù)度值從小到大，顏色由暗變亮；節(jié)點(diǎn)間的連線根據(jù)相互作用強(qiáng)度由細(xì)到粗，見圖6。

圖6 核心靶點(diǎn)的PPI關(guān)系圖

Excel求取成分和疾病的交集靶點(diǎn)，得到16個(gè)交集靶點(diǎn)蛋白，上傳到DAVID 6.8在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行KEGG信號通路的生物學(xué)富集分析[19-21]，KEGG通路富集分析篩選得到40條結(jié)果(P<0.05)，篩選出富集靶點(diǎn)最多的前15條結(jié)果，刪除一些疾病如“癌癥”“乙肝”“類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎”等，最終得到MAPK、TNF、Chemokine、Toll-like 4條通路，均參與炎癥反應(yīng)，見圖7。

圖7 差異性成分的KEGG代謝通路富集分析

3 討論

3.1 指紋圖譜條件優(yōu)化 參照課題組前期研究[22]，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿在210 nm處有最大吸收；新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C在345 nm處有較大吸收；桂皮醛在300 nm處有最大吸收。根據(jù)馮了性風(fēng)濕跌打藥酒中不同成分的吸收波長，以及實(shí)驗(yàn)過程中指紋圖譜體現(xiàn)的色譜峰信息，最終選擇了本研究采用的波長切換方法。

3.2 指紋圖譜模式識別及鑒定方法 共標(biāo)定了29個(gè)共有峰，相似度在0.9以上，表明不同批樣品具有較強(qiáng)的一致性，這證明采用大果飛蛾藤作為丁公藤替代品投料，在實(shí)際應(yīng)用中較難鑒別。PCA分析將9批樣品自動(dòng)分為丁公藤投料和大果飛蛾藤投料2類，PLS-DA分析證實(shí)了PCA分類結(jié)果，且模型擬合程度較好，具有較強(qiáng)的預(yù)測性。利用VIP分析發(fā)掘差異性變量，分別為新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸B。但3種差異性成分在丁公藤、大果飛蛾藤投料的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒中均有分布，僅存在含量上的差異，這為不同投料藥酒的鑒別帶來困難。

本研究探索將差異性成分與不同投料藥酒中標(biāo)志性成分的峰面積比值范圍，用于藥酒的快速鑒別。3種差異性成分中，新綠原酸、隱綠原酸指紋圖譜色譜行為較好，不同投料藥酒中新綠原酸、隱綠原酸與東莨菪內(nèi)酯峰面積的比值95%置信區(qū)間不存在重合，故此選擇此2個(gè)指標(biāo)用于藥酒的快速鑒別。采用規(guī)定峰面積比值范圍的鑒別方法相比含量測定法更為簡便、快捷，且能夠克服在藥酒制備過程中藥材吸附，轉(zhuǎn)移過程中藥液損失等造成的成分含量的差異。指紋圖譜中93.00 min處的專屬峰，未能通過標(biāo)準(zhǔn)品比對實(shí)現(xiàn)鑒定，因此僅作為采用峰面積比值范圍鑒定的補(bǔ)充。

3.3 差異性成分網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究 本研究通過構(gòu)建成分-疾病-蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)相互作用關(guān)系圖，提取出核心網(wǎng)絡(luò)，篩選出度值排名前10的核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)。通過KEGG分析得到差異性成分治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎所作用的信號通路。MAPK信號通路被激活后參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)，炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程，同時(shí)參與多種應(yīng)激反應(yīng)的信號傳導(dǎo)[23]。秦理等[24]發(fā)現(xiàn)阻斷MAPK通路，能夠抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的遷徙與侵襲，有助于減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。TNF是炎癥細(xì)胞因子的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病變密切相關(guān)[25]。TLR是一種天然免疫識別受體，激活Toll-like信號通路可導(dǎo)致各種炎癥性因子表達(dá)升高[26]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞、滑膜組織、滑液等均存在TLRs表達(dá)增加[27]。采用丁公藤替代品大果飛蛾藤投料制得的馮了性風(fēng)濕跌打藥酒中新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸B的含量顯著高于丁公藤藥材投料制得的藥酒，而此3種差異性成分主要通過作用于MAPK、TNF、Chemokine、Toll-like 4條信號通路發(fā)揮抗風(fēng)濕藥效，這提示采用兩種藥材投料制備的藥酒在作用于此4條通路上存在一定藥效差異。當(dāng)然，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的結(jié)果仍需進(jìn)一步的藥效學(xué)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

表2中規(guī)定的鑒別范圍，由于采用少數(shù)樣品來估計(jì)總體值，不排除存在離群值及抽樣誤差，但以此為突破口，為快速鑒定不同投料馮了性風(fēng)濕跌打藥酒提供了可能。丁公藤、光葉丁公藤樣本極難采收，這為本研究帶來了客觀困難，后續(xù)課題組將持續(xù)采收丁公藤藥材，以為本研究提供更多的數(shù)據(jù)支撐。