李 麗， 張 超， 鄭 威， 于穎琦， 張 凡， 高 慧

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600)

黃柏，習稱川黃柏，為蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid的干燥樹皮，味苦性寒，具有清熱燥濕、解毒療瘡、瀉火除蒸的功效[1]。黃柏中含有大量生物堿類、檸檬苦素類成分，其中生物堿類作為主要的活性成分[2]，包括黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿等，具有抗炎[3]、抑菌[4]、調(diào)節(jié)代謝[5]、抗氧化[6]等藥理作用。小檗紅堿作為黃柏鹽炙過程中由小檗堿轉化新生成的成分，同樣具有抗炎、抑菌的功效[3]，同時巴馬紅汀、藥根紅堿作為實驗室自制成分，由巴馬汀、藥根堿分別轉化而得，與小檗紅堿具有相似的化學轉化歷程，推測其與小檗紅堿具有相似的藥理作用，故本研究將小檗紅堿、巴馬紅汀、藥根紅堿也作為含量測定的指標性成分。此外，黃柏藥材中還含有檸檬苦素類成分黃柏酮和黃柏內(nèi)酯，黃柏味苦性寒，苦味藥多用治熱證，具有清熱燥濕、瀉火的功效，檸檬苦素類與生物堿類成分均是黃柏具有苦味的原因[7]，同時具有抗菌[8]、抗炎[9]、抗癌[10]等藥理活性，因此本實驗亦將黃柏酮與黃柏內(nèi)酯納入指標，以期更加全面的評價黃柏飲片。

目前測定黃柏中生物堿類、檸檬苦素類成分含量的測定方法主要是HPLC法[7, 11]，其不足之處主要是需要在2個色譜條件下分別測定這兩類成分，且黃柏藥材中各成分之間含量差異大，實驗室前期曾采用液相色譜法測定，發(fā)現(xiàn)各成分間相互干擾嚴重，多種成分含量同時測定色譜條件摸索困難，而UPLC-QqQ-MS作為一種新的分析技術，其質譜采用特定離子對掃描模式，可以通過提取質量色譜圖準確鑒別化合物，克服了液相色譜分離度差的問題，靈敏度高，在短時間內(nèi)即可達到有效分離[12]，擁有更低的定量下限[13]，節(jié)約時間與成本。

古代醫(yī)籍中關于黃柏炮制方法較為豐富，醫(yī)者多會根據(jù)臨床使用的需要而選取不同的輔料和方法對其加以炮制?，F(xiàn)今對于黃柏的炮制方法研究多集中在鹽黃柏、酒黃柏、黃柏炭等幾個炮制品種，并報道其含有的化學成分在炮制的過程中會出現(xiàn)明顯的質變和量變的情況[14]。鹽炙法是傳統(tǒng)中藥炮制方法之一，也是目前黃柏的主流炮制方法，鹽黃柏始載于《雷公炮炙論》，2020年版《中國藥典》沒有明確的炒制時間與炒制溫度，為了有效控制鹽黃柏飲片的質量，并進一步研究鹽黃柏在炒制過程中活性成分量變規(guī)律，故本實驗中采用UPLC-QqQ-MS法對黃柏生品及其不同炒制程度的鹽炙品中10種成分進行含量測定，以發(fā)現(xiàn)不同炒制溫度、炒制時間鹽黃柏中活性成分量變規(guī)律，并為鹽黃柏質量評價及質量標準提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQD超高效液相色譜串聯(lián)飛行質譜儀(美國Waters公司，包括MassLynx 4.1工作站)；FA1004B型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；AE240型分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Milli-Q型超純水儀(美國Millipore公司)；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 木蘭花堿(四川省維克奇生物科技有限公司，批號wkq16050801)；鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿(均購自成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為MUST-16031814、MUST-16040702)；鹽酸巴馬汀(上海圻明生物科技有限公司，批號151120)；小檗紅堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮、黃柏堿(大連美侖生物科技有限公司，批號分別為A1107AS、M0606AS、F0102AS、M0107AS)；巴馬紅汀及藥根紅堿均為實驗室自制(純度>98%)；無碘鹽(購自大連鹽業(yè)有限公司)。質譜級甲醇、乙腈均購于日本Sigma公司，色譜級甲醇，水為超純水，其他試劑均為分析純。

黃柏藥材購自四川雅安，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學翟延君教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮。

2 方法

2.1 炮制品制備

2.1.1 生黃柏 取黃柏原藥材，洗凈，潤透，切細絲，干燥，即得。

2.1.2 不同炮制程度的鹽黃柏 取生黃柏，放入適宜的容器中，加鹽水拌勻(每100 g黃柏使用2 g食鹽)，悶潤2 h，使得輔料鹽水被黃柏吸盡，在炒制容器內(nèi)于130～140、150～160、170～180 ℃下分別炒制3、4、5、6、7 min，取出，放涼，即得。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取黃柏堿、木蘭花堿、藥根紅堿、藥根堿、巴馬紅汀、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮對照品置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，制備成質量濃度分別為0.091 2、0.031、0.010 5、0.049、0.002 9、0.137 25、0.001 275、0.418、0.088、0.004 85 mg/mL混合對照品溶液，4 ℃冷藏，備用。

2.2.2 供試品溶液 取生黃柏、不同炒制程度鹽黃柏適量，粉碎，過60目篩，分別精密稱取0.2 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL 1%醋酸甲醇溶液，稱定質量，超聲(250 W，40 kHz)處理30 min，取出，放冷，用1%醋酸甲醇溶液補足失質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.25 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量1 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.4 質譜條件 采用電噴霧離子源(ESI源)，正離子掃描模式；離子掃描范圍m/z50～1 000；毛細管電離電壓3.5 kV；源溫度150 ℃；脫溶劑溫度250 ℃；脫溶劑氣體體積流量800 L/h；錐孔氣體體積流量50 L/h；多反應監(jiān)測模式(MRM)。10種成分的質譜參數(shù)見表2，MRM模式下的色譜圖、總離子流圖見圖1～2。

表2 黃柏中10種成分質譜MRM模式下參數(shù)

1.黃柏堿 2.木蘭花堿 3.藥根紅堿 4.藥根堿 5.巴馬紅汀 6.小檗紅堿 7.巴馬汀 8.小檗堿 9.黃柏內(nèi)酯 10.黃柏酮

1.黃柏堿 2.木蘭花堿 3.藥根紅堿 4.藥根堿 5.巴馬紅汀 6.小檗紅堿 7.巴馬汀 8.小檗堿 9.黃柏內(nèi)酯 10.黃柏酮

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.02、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，加入適量甲醇溶液，定容至10 mL，制備成系列混合對照品溶液，在“2.3”“2.4”項條件下測定，并記錄各測定成分峰面積，以對照品的質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行回歸，結果見表3。

表3 各成分線性關系

2.5.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，在“2.3”“2.4”項條件下重復進樣6次，測定黃柏堿、木蘭花堿、藥根紅堿、藥根堿、巴馬紅汀、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮峰面積RSD分別為2.67%、2.01%、2.02%、1.78%、1.55%、1.01%、0.98%、0.97%、1.23%、1.11%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一鹽黃柏供試品溶液，分別于0、2、4、6、10、24 h，在“2.3”“2.4”項條件下進樣，測得黃柏堿、木蘭花堿、藥根紅堿、藥根堿、巴馬紅汀、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮峰面積RSD分別為1.34%、1.56%、0.99%、2.03%、2.22%、1.75%、1.64%、1.44%、1.43%、0.98%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復性試驗 精密稱取同一批鹽黃柏樣品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”“2.4”項條件下進樣，測得黃柏堿、木蘭花堿、藥根紅堿、藥根堿、巴馬紅汀、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮含量RSD分別為1.30%、1.34%、1.21%、1.45%、1.34%、1.31%、0.99%、1.76%、1.89%、2.02%，表明該方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 取已知含量的鹽黃柏樣品0.1 g，平行6份，精密稱定，分別精密加入對照品適量(與0.1 g鹽黃柏樣品成分含量相當)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”“2.4”項條件下測定含量，計算回收率。黃柏堿、木蘭花堿、藥根紅堿、藥根堿、巴馬紅汀、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮的平均回收率分別為100.55%、99.83%、97.68%、99.78%、97.24%、100.46%、97.88%、102.23%、99.61%、96.79%，RSD分別為0.61%、0.01%、0.66%、0.13%、0.26%、0.79%、0.37%、0.41%、0.48%、0.36%。

2.6 樣品含量測定 分別精密稱取生黃柏、不同炒制程度鹽黃柏粉末0.2 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”“2.4”項條件下進樣，計算各成分含量，結果見表4、圖3。

表4 生黃柏及不同炒制程度鹽黃柏各成分含量測定結果(mg/g)

圖3 黃柏生品、鹽炙品中各成分變化趨勢圖

3 結果

由含量測定結果可知，鹽黃柏炒制過程中黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿、及黃柏內(nèi)酯6種成分的含量整體呈下降趨勢，尤其在170～180 ℃炒制溫度下6種成分的含量下降最為顯著；巴馬紅汀、小檗紅堿、藥根紅堿3種成分含量整體呈上升趨勢，尤其在170～180 ℃炒制溫度下3種成分含量上升最為顯著；黃柏酮在170～180 ℃、炒制4 min時含量較高。

在炒制溫度130～140 ℃、炒制時間6～7 min條件下檢測到新成分巴馬紅汀，且在170～180 ℃、3 min條件下巴馬紅汀含量最高，同一炒制時間下，高溫較低溫條件下巴馬紅汀的含量更高；小檗紅堿含量隨著炒制時間和炒制溫度增加整體呈上升趨勢，小檗堿含量呈下降趨勢，在170～180 ℃、6～7 min條件下小檗堿含量降低最為明顯；藥根紅堿含量隨著炒制時間和炒制溫度的增加整體呈上升趨勢，藥根堿含量隨著炒制時間的增加整體呈降低趨勢，在170～180 ℃、6～7 min條件下藥根堿含量降低最為顯著。

4 討論

不同炮制程度的鹽黃柏在炮制過程中，顏色由黃色逐漸變?yōu)榧t褐色，提示著黃柏中的化學成分可能發(fā)生了變化[15]，在前期研究當中發(fā)現(xiàn)黃柏在炮制過程其小檗堿成分發(fā)生了質變，且隨著炮制溫度的升高、時間的延長，鹽炙黃柏中部分鹽酸小檗堿轉化為小檗紅堿[16]，此反應的發(fā)生條件在120 ℃以上[17]，且溫度控制在180 ℃、炒制時間控制在8 min時小檗紅堿的含量最高；而此外黃柏中藥根堿、巴馬汀等成分同為小檗原堿型生物堿，化學結構構型與小檗堿成分類似，故推測黃柏在炮制前后其藥根堿、巴馬汀成分與小檗堿一樣也會發(fā)生相應的化學變化。實驗室后期對藥根堿和巴馬汀化學成分單體進行了模擬炮制研究，發(fā)現(xiàn)黃柏在鹽炙過程中藥根堿、巴馬汀成分與小檗堿一樣發(fā)生了類似的化學反應歷程，即為藥根堿轉化為藥根紅堿[18]，巴馬汀轉化為巴馬紅汀。從目前的文獻報道來看尚未見有對黃柏鹽炙過程中藥根紅堿和巴馬紅汀2種新成分量變變化研究的報道，基于此，本實驗采取了溫度為130～180 ℃、炒制時間3～7 min的炮制條件，使用UPLC-QqQ-MS法，在正離子模式下同時測定了黃柏生品及其鹽炙品中生物堿類和檸檬苦素類共10種成分，同時包含了2種新生成成分，以期可為黃柏飲片及其制劑成分的分析和質量控制提供一定的科學依據(jù)。

通過上述實驗表明，黃柏經(jīng)鹽炙后其化學成分發(fā)生了量變和質變，從而也會對黃柏體內(nèi)代謝產(chǎn)物和入血成分產(chǎn)生相應的影響，最終導致其藥性和功效的變化。在闡釋黃柏炮制原理的過程中，以單一成分的改變并不能很好的表征整個黃柏炮制過程的功效和藥性變化，故本實驗采用了液質聯(lián)用技術對黃柏中生物堿類和檸檬苦素類10種成分的量變變化進行了全面分析。但為了更深入的解析鹽黃柏的炮制原理，還應結合體內(nèi)代謝、吸收過程的考察，運用現(xiàn)代聯(lián)用技術，分析黃柏鹽炙過程中活性成分經(jīng)體內(nèi)Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝的產(chǎn)物分析鑒定，建立一種快速有效的黃柏代謝產(chǎn)物分析方法，為進一步明確鹽黃柏在體內(nèi)的藥效物質基礎及其質量控制的研究奠定基礎，也為鹽黃柏的藥理活性研究以及臨床上的開發(fā)利用提供參考。