俞靜靜， 杜宇忠， 蘇 潔， 顏美秋， 笈文娜， 吳玉蘭， 陳素紅， 呂圭源*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2.浙江工業(yè)大學(xué)，浙江 杭州 310014)

高膽固醇血癥是冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死、腦卒中等多種心腦血管疾病的直接誘因[1]，而心血管疾病每年的致死率均高于其他疾病因素，已成為全球死亡的主要原因[2]。動脈粥樣硬化主要是由于血清膽固醇異常升高，低密度脂蛋白膽固醇等脂質(zhì)顆粒在動脈血管壁的沉積所致[3]，臨床治療常以他汀類降脂藥物為主，主要通過抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶活性，阻斷人體細(xì)胞里的羥甲戊酸的代謝途徑，減少總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的合成，加速血清內(nèi)的膽固醇清理速度，抑制肝臟中載脂蛋白的合成，從而起到降脂保護(hù)心血管的作用[4]。

中醫(yī)古籍中的“膏”“脂”類似于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的“血脂”[5]，現(xiàn)代中醫(yī)藥治療大多從痰濁、瘀血入手。陳皮為蕓香科植物橘CitrusreticulateBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，性溫，味辛、苦，入脾、肺經(jīng)，具有理氣健脾，燥濕化痰之效[6]，課題組前期發(fā)現(xiàn)該藥材具有降脂藥效，同時可避免口服西藥所致肝腎損傷等不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)探索陳皮對高膽固醇血癥大鼠的預(yù)防作用及機(jī)制，以期為今后相關(guān)治療提供參考。

1 材料

1.1 動物 48只健康雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量(400±20)g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(浙)2008-0033，動物合格證號0007835，基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 試劑與藥物 陳皮(批號120601，浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司);辛伐他汀分散片(批號3137813，20 mg/片×7片，廣州南新制藥有限公司)。豬油(農(nóng)華豬油，批號20140214，杭州世紀(jì)聯(lián)華超市)；膽固醇(杭州誠信醫(yī)療儀器有限公司)；去氧膽酸鈉(Sodium deoxycholate)(批號130801，上海伯奧生物科技有限公司)；丙賽優(yōu)(丙硫氧嘧啶片)(批號31131210，精華制藥集團(tuán)股份有限公司)；聚山梨酯80(吐溫-80)(批號20130301，溫州清明化工有限公司)；1,2-丙二醇(批號20110705，如皋市化學(xué)試劑廠有限公司)。血清總膽固醇(TC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿酸(UA)、肌酐(Cr)試劑盒(批號20140417、20140401、20140403、20140407、20140226(寧波美康生物科技股份有限公司)；載脂蛋白A1(ApoA1)、載脂蛋白B(ApoB)、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)、膽固醇7α羥化酶(CYP7α1)、卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(LCAT)、酰基輔酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)ELISA試劑盒(批號20140601A)(上海源葉生物科技有限公司)。

1.3 儀器 TBA-40FR全自動生化儀(日本東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會社)；MoorFLPI散斑全幀實(shí)時掃描成像系統(tǒng)/固態(tài)恒溫激光發(fā)射器(英國Moor公司)；Microcl17微量離心機(jī)(美國Thermo公司)；DS-671電子計重天平(上海寺岡電子有限公司)；PK-324電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；WH-861渦懸混合器(太倉市科教器材廠)；FB2204B電子天平(上海精科天美儀器有限公司)；純水系統(tǒng)(杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司)。

2 方法

2.1 藥液制備 取陳皮飲片，加10倍95%乙醇提取3次，每次1 h，趁熱過濾，合并提取液，提取液減壓濃縮至適量，加少量吐溫-80(使其終體積分?jǐn)?shù)約3.0%)并加熱超聲使其均勻溶解，再加水至0.5 g/mL，蒸餾水稀釋至0.25、0.125 g/mL，即得高、中、低3個劑量組。取辛伐他汀分散片，置錐形瓶內(nèi)，加蒸餾水超聲使溶解，制得0.4 mg/mL溶液。

2.2 模型建立 配制脂肪乳劑，方法為取25 g豬油放在100 mL燒杯里，放在磁力攪拌器上加熱，待溫度升到100 ℃時，加入10 g膽固醇融化，加入1 g丙賽優(yōu)充分?jǐn)噭颍尤?5 mL吐溫-80制成油相；在另一燒杯中加入30 mL蒸餾水、20 mL丙二醇，放在電爐上加熱至60 ℃，加入2 g去氧膽酸鈉充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，制成水相，將水相加入油相，充分混勻后加蒸餾水至100 mL，即得脂肪乳劑[7]。造模時，脂肪乳劑與雙蒸水按1∶1比例稀釋，其間除正常組灌胃給予蒸餾水外，其余各組每天下午分別灌胃給予相應(yīng)體積的脂肪乳劑(1 mL/100 g)，每天1次。

2.3 分組與給藥 48只大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，陽性對照組(4×10-3g/kg辛伐他汀)及陳皮95%乙醇提取物高、中、低(5、2.5、1.25 g/kg)劑量組，正常組和模型組灌胃給予相應(yīng)體積蒸餾水，各給藥組灌胃給予相應(yīng)藥液，連續(xù)4周，每天觀察記錄大鼠活動狀態(tài)，每3 d稱定1次體質(zhì)量。

2.4 血脂、肝腎功能指標(biāo)檢測 末次給藥后，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血(取血前禁食不禁水12 h)，3 500 r/min低溫離心10 min，吸取血清，全自動生化分析儀檢測血清TC、LDL-c水平，以評價醇提物對血脂的調(diào)節(jié)作用；血清AST、ALT水平，以評價肝細(xì)胞受損后醇提物對其改善程度；血清Cr、UA水平，以評價醇提物對腎功能的改善作用。

2.5 尾部微循環(huán)檢測 給藥后4周，采用MoorFLPI散斑全幀實(shí)時掃描成像系統(tǒng)的激光多普勒技術(shù)，檢測各組微循環(huán)血流量。在實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜(27 ℃)及清醒狀態(tài)下，將大鼠尾部置于掃描頭正下方視野處，選定約1 cm處5×5像素面積的區(qū)域，檢測皮下1 mm血流量，持續(xù)2 min(儀器參數(shù)為掃描距離35 cm，掃描速度每秒25幀圖像，掃描精度低分辨率)，實(shí)驗(yàn)過程中務(wù)必保證大鼠安靜。

2.6 ELISA法檢測血清相關(guān)因子水平 末次給藥后，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血(取血前禁食不禁水12 h)，37 ℃水浴靜置1 h后3 500 r/min離心10 min，分離血清，ELISA法檢測血清ApoA1、ApoB、HMGCR、CYP7α1、ACAT、LCAT水平。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般體征、體質(zhì)量、臟器系數(shù)、肝臟狀態(tài) 正常組大鼠皮毛光澤，行動靈活，進(jìn)食量及大便正常；模型組大鼠食量減少，皮毛發(fā)黏，大便稀溏。給藥期間，與正常組比較，模型組及各給藥組大鼠體質(zhì)量無明顯變化(P>0.05)。給藥4周后，與正常組比較，模型組大鼠各臟器系數(shù)均增加(P<0.01)；與模型組比較，陳皮95%乙醇提取物高、中劑量組心、脾、腎、肝系數(shù)降低(P<0.05，P<0.01)，低劑量組僅心、腎系數(shù)降低(P<0.05)，見表1。

表1 陳皮95%乙醇提取物對高脂大鼠體質(zhì)量和臟器系數(shù)的影響

由圖1可見，與正常組比較，模型組大鼠肝臟發(fā)白、腫脹，肉眼可見明顯白色點(diǎn)；與模型組比較，各給藥組都能明顯改善大鼠肝臟狀態(tài)。

注：1～6分別為正常組、模型組、陽性對照組、陳皮95%乙醇提取物高劑量(5 g/kg)組、陳皮95%乙醇提取物中劑量(2.5 g/kg)組、陳皮95%乙醇提取物低劑量(1.25 g/kg)組。

3.2 大鼠血脂指標(biāo) 給藥4周后，與正常組比較，模型組大鼠血清TC、LDL-c水平升高(P<0.01)；與模型組比較，陳皮95%乙醇提取物各劑量組大鼠血清TC、LDL-c水平降低(P<0.01)，并呈一定的量效關(guān)系，見圖2。

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 大鼠血清ApoA1、ApoB水平 給藥4周后，與正常組比較，模型組大鼠血清ApoA1水平降低(P<0.01)，ApoB水平升高(P<0.01)；與模型組比較，陳皮95%乙醇提取物高劑量組大鼠血清ApoA1水平升高(P<0.01)，ApoB水平降低(P<0.01)，見圖3。

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

3.4 大鼠血清肝功能指標(biāo) 給藥4周后，與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST活性升高(P<0.05)；與模型組比較，陳皮95%乙醇提取物高劑量組可降低大鼠血清ALT、AST活性(P<0.05)，中劑量組僅降低ALT活性(P<0.05)，見圖4。

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.5 大鼠血清腎功能指標(biāo) 給藥4周后，與正常組比較，模型組大鼠血清UA、Cr水平增加(P<0.01)；與模型組比較，陳皮95%乙醇高劑量組大鼠血清UA水平降低(P<0.05)，而對血清Cr水平無明顯影響(P>0.05)，見圖5。

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

3.6 大鼠尾部微循環(huán)血流量 給藥4周后，與正常組比較，模型組大鼠尾部微循環(huán)血流量減少(P<0.01)；與模型組比較，陳皮95%乙醇提取物高劑量組大鼠尾部微循環(huán)血流量增加(P<0.05)，見圖6。

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

3.7 大鼠血清HMGCR、CYP7α1活性 給藥4周后，與正常組比較，模型組大鼠血清HMGCR活性升高(P<0.01)，CYP7α1活性降低(P<0.01)；與模型組比較，陳皮95%乙醇提取物高劑量組大鼠血清HMGCR活性降低(P<0.01)，見圖7。

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

3.8 大鼠脂質(zhì)代謝轉(zhuǎn)運(yùn)酶 給藥4周后，陳皮醇提物對LCAT、ACAT活性無明顯影響(P>0.05)，見圖8。

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

4 討論

隨著現(xiàn)代生活水平的提高、膳食結(jié)構(gòu)的改變和生活方式的轉(zhuǎn)變，高脂血癥的發(fā)病率正日漸增高，且呈年輕化趨勢[8]。氣機(jī)升降正常，臟腑功能有序可凈化多余的脂濁[9]。陳皮作用于脂代謝紊亂疾病中可調(diào)暢氣機(jī)，疏利水氣血津液的運(yùn)行，防止氣滯痰濁淤血，對高脂血癥具有一定的改善作用。

《景岳全書》有“腎主水，水泛亦為痰”之說，《醫(yī)學(xué)入門》有“痰源于腎”之論?！堆C論》有“木之性主于疏泄，食氣入胃，全賴肝木之氣疏泄之而水谷乃化”。可見，高脂血癥與肝腎功能密切相關(guān)。苗杰等[10]通過鏡檢尿液有形成分發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞脂肪變性和脂肪管型，這可能是腎功能受高脂血癥影響的表現(xiàn)。隨著高脂血癥患者的日益增多，其中不乏有酒精肝、脂肪肝之輩[11]，此類人群血脂升高同時伴有肝功能異常。通過檢測模型大鼠血清AST、ALT、Cr、UA水平發(fā)現(xiàn)，陳皮醇提物具有一定的降尿酸作用和肝保護(hù)作用。陳皮在改善高脂血癥疾病過程的同時，還可改善肝腎功能。

脂蛋白可直接參與血漿脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)清除代謝過程[12]。ApoA1是HDL的載脂蛋白，可使游離的TC發(fā)生酯化，驅(qū)動膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，減少膽固醇在細(xì)胞內(nèi)的堆積，并促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊狀膽固醇的清除，參與介導(dǎo)HDL對血管壁的保護(hù)作用[13]。ApoB是LDL-c的主要蛋白，在脂類的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程中起著極其重要的作用[14]。ApoB/ApoA1的比例可能為預(yù)測心血管不良事件發(fā)病率的重要指標(biāo)[15]。陳皮醇提物在調(diào)控模型大鼠ApoA1和ApoB水平的同時，可增加大鼠微循環(huán)血流量，充分起到降脂和保護(hù)心血管的作用。結(jié)論與已有報道一致[16]。

HMGCR是膽固醇合成的限速酶，參與膽固醇的合成[17]。調(diào)控HMGCR活性是維持體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵步驟[3]。目前他汀類藥物主要是通過調(diào)控HMGCR活性，減少膽固醇的內(nèi)源性合成，達(dá)到降脂的目的。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)陳皮同樣具有抑制HMGCR活性，降低TC和LDL-c水平的作用，結(jié)合陳皮降尿酸和肝保護(hù)作用，推測陳皮是治療高膽固醇血癥的有效藥物。實(shí)驗(yàn)期間同時檢測了血清CYP7α1、ACAT和LCAT的活性，以期從多靶點(diǎn)、多層面的角度深入研究其降膽固醇機(jī)制，但是效果并不明顯。究其原因可能為CYP7α1是膽固醇在肝臟轉(zhuǎn)化為膽汁酸的限速酶[18]；ACAT是細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯化的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和酯化膽固醇的平衡，LCAT可將細(xì)胞外HDL的游離膽固醇酯化[19]。實(shí)驗(yàn)選用血清作為檢測材料，而這些指標(biāo)主要是在肝細(xì)胞中表達(dá)，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，陳皮醇提物在改善高膽固醇血癥疾病過程中，表現(xiàn)出與他汀類藥物相同的治療效果，同時陳皮還具有保護(hù)肝腎功能，改善體內(nèi)主要臟器腫大和增加微循環(huán)血流量的作用，充分體現(xiàn)出中醫(yī)藥多層面、不良反應(yīng)小的優(yōu)勢和特色。其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控HMGCR的活性，抑制內(nèi)源性膽固醇合成，同時調(diào)控載脂蛋白的水平，減少膽固醇的蓄積，起到降低血液中LDL-c和TC作用。