李大樂,陳建文,張 紅,李君劍

山西大學黃土高原研究所, 太原 030006

在2014年的全國土壤污染調查報告中顯示,重金屬Cd、Pb嚴重超標[1]。Cd以移動性大、毒性高、污染面積大被稱為“五毒之首”,并且被國際癌癥研究機構列為第一類致癌物[2]。Pb可通過空氣、水、土壤和食物等多種途徑進入人體,嚴重影響人體的中樞神經系統(tǒng)、腎臟和血壓[3]。為了評估Pb、Cd對生物的生態(tài)風險,必須建立一套生態(tài)有效的指標體系,從而準確量化重金屬在環(huán)境污染治理中的毒性[4]。瑞典科學家Hakanson提出的潛在生態(tài)危害指數法(The Potential Ecological Rick Index,RI)[5]是目前最常用的評價重金屬污染程度的方法之一,它可以用來表征生態(tài)系統(tǒng)所面臨的由多種重金屬引起的整體生態(tài)風險。因此,被廣泛應用在生物毒理學、環(huán)境化學和生態(tài)學等多個研究領域[6]。

毒性系數(The Toxic Factor,TF)作為RI中的關鍵參數,是Hakanson利用工業(yè)化前火成巖、土壤、淡水和陸生動植物中重金屬的濃度所建立。但由于微生物中重金屬濃度難以獲取,Hakanson并沒有將其考慮其中。微生物作為土壤的重要組成部分,在分解有機質、養(yǎng)分循環(huán)和改變養(yǎng)分對植物的可利用性方面發(fā)揮著至關重要的作用[7]。許多研究表明土壤中Cd和Pb含量達到一定濃度時,會導致微生物群落的變異性增大,降低群落穩(wěn)定性[8- 9]。Schneider等[10]研究結果表明隨著土壤Pb濃度升高疣微菌門的豐度降低,Li等[11]研究結果表明硫桿菌屬、Bellilinea和Gp16與土壤Cd含量呈顯著正相關,而Longilinea、Gp2和Gp4呈顯著負相關。并且在Pb和Cd復合污染下細菌豐富度和多樣性均顯著低于未污染土壤[12]。因此,探究Pb、Cd的TF值是否適用于評估重金屬對微生物的生態(tài)風險具有重要的意義。

本研究在相同生態(tài)風險水平下設計Pb污染和Cd污染,構建微宇宙實驗,利用Biolog-ECO板和高通量測序技術分析Pb和Cd對微生物功能多樣性和群落結構的影響,對比兩者之間的差異性,探究Pb和Cd的TF值是否適用于評估重金屬污染微生物的潛在生態(tài)風險,為重金屬生態(tài)風險評價提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及理化性質的測定

土壤樣品采集地位于山西省天龍山自然保護區(qū)的一處油松林(37°42′N,112°27′E),清除表面覆蓋物,采集0—10 cm處表層土壤,類型為褐土。土壤去除根系、枯落物,過2 mm篩后分為兩份,一份用于微宇宙實驗,一份自然風干后用于理化性質的測定。土壤總氮(TN)、總碳(TC)和總硫(TS)由元素分析儀(vario macro cube, elementar, Germany)測定,采用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS, Thermo Elemental, X7系列)測定砷(As)、鎘(Cd)、鉻(Cr)、銅(Cu)、鎳(Ni)、鉛(Pb)和鋅(Zn)的濃度(表1)。

表1 土壤理化性質

1.2 潛在生態(tài)危害指數法(RI)

潛在生態(tài)危害指數法(RI)的計算公式：

1.3 微宇宙實驗

微宇宙實驗的建立：稱取相當于40 g干重的土壤置于150 mL的培養(yǎng)杯中,以原始土壤中的重金屬含量為背景值,根據上述的潛在生態(tài)危害指數(RI),通過向培養(yǎng)杯中添加不同濃度的Pb (CH3COO)2和CdCl2,獲得強(H,RI=400)、中等(M,RI=200)和輕微(L,RI=100)3種生態(tài)風險水平,原始土壤作為空白對照(CK),分別記作H-Pb、H-Cd、M-Pb、M-Cd、L-Pb、L-Cd和CK,各3個重復。土壤樣品中Pb和Cd的含量及生態(tài)風險如表2所示,由于Pb和Cd的毒性系數分別為5和30,所以CK的RI水平為35。調節(jié)土壤樣品的充水孔隙度(WFPS)為60%,置于恒溫培養(yǎng)箱中25℃黑暗條件下培養(yǎng),每2 d打開一次保證其有氧條件,45 d后破壞性取樣進行后續(xù)分析。

表2 微宇宙培養(yǎng)土壤處理

1.4 土壤微生物功能多樣性的測定

利用Biolog-ECO板對微生物群落功能多樣性進行分析。稱取相當于5 g干重的土壤置于三角瓶中,加入45 mL無菌0.9% NaCl溶液,振蕩30 min(轉速200 r/min)后,靜置30 min后吸取土壤樣品上清液并稀釋到0.1%,再用8通道加樣器將稀釋液接種到Biolog-ECO生態(tài)測試板上,接種量為150 μL,每樣1板,每板3個重復。將接種好的測試板加蓋,在25℃下連續(xù)培養(yǎng)10 d,每隔24 h用Infinite 200 PRO(TECAN, Sweden)在590 nm下測定其吸光度。土壤細菌群落利用碳源的整體能力用平均顏色變化率(Average well color development,AWCD)表示,選擇細菌群落生長平臺初期的AWCD值進行碳源利用功能多樣性分析,土壤細菌群落功能多樣性指數分析采用Shannon指數(H)、Simpson指數(D)和McIntosh指數(U),AWCD值和指數的計算公式詳見文獻[14]。

Biolog-ECO平板技術測定的群落功能多樣性指數是利用不同種類的微生物對碳源的利用能力不同而產生的不同碳源利用模式來表征微生物群落差異。其中,Shannon指數(H)可以表征土壤中細菌群落豐富度,McIntash指數(U)則可反映土壤中細菌群落均勻度,Simpson指數(D)可以評估土壤中細菌群落優(yōu)勢度(指數越高,微生物多樣性越低),以上3種指數表征細菌群落的功能多樣性。

1.5 DNA提取、定量PCR及高通量測序

使用Ultra-cleanTM土壤DNA分離試劑盒(MoBio Laboratory,USA)從0.25 g土壤中提取各生態(tài)風險水平下土壤的DNA。通過定量PCR測定土壤細菌豐度,引物為338F(5′-ACTCCTACGAGGAGCA- 3′)和534R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC- 3′),反應體系為20 μL：7.6 μL ddH2O,10 μL SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ,2.0 μL樣本DNA,條件為: 95℃變性10 min, 95℃變性30 s,53℃退火45 s,72℃延伸90 s,35個循環(huán)。

采用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTW-TCTAAT- 3′)引物對16S rRNA基因的V3—V4可變區(qū)域進行PCR擴增。擴增體系為20 μL,擴增條件為：95 ℃預變性3 min,循環(huán)條件為：95℃變性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸45 s,29個循環(huán),72℃終延伸10 min。擴增產物純化并利用NanoDrop 2000測定DNA純度和濃度。在Illumina公司的MiSeq PE300平臺上進行測序。

1.6 生信分析

首先使用fastp軟件對原始測序序列進行質控,過濾去除低質量序列。使用Uparse軟件根據97%的相似度對序列進行OTUs聚類,在聚類過程中去除嵌合體。在Silva 16S rRNA數據庫(v138)中對基因序列進行比對,采用RDP classifier方法(置信閾值為0.7)對每條序列進行物種分類注釋,得到的OUTs數據按最小樣本序列數抽平進行后續(xù)統(tǒng)計分析。通過計算獲得每個土壤樣品中細菌群落的基因多樣性指數(ACE、Chao1、Shannon)與上述的功能多樣性指數不同,此處的多樣性指數是指基于分類學的多樣性指標(taxonomic diversity),這些指標在一定程度上反映了群落或生態(tài)系統(tǒng)的某些特性,其中,Chao1和ACE指數反應細菌群落的豐富度,指數越大,群落的豐富度越高；Shannon指數綜合反應細菌群落的豐富度和均勻度,指數越大,群落的多樣性越高。高通量測序和生信分析在美吉生物醫(yī)藥科技有限公司(上海)完成。

1.7 數據分析

采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較相同生態(tài)風險水平下土壤的細菌豐度、孔平均顏色變化率(AWCD)、碳源代謝強度、功能多樣性指數和基因多樣性指數的差異。采用主成分分析(PCA)對土壤細菌群落31種碳源的AWCD值進行分析。數據通過Excel 2013和SPSS 24.0進行處理和分析,作圖采用Excel 2018、R 3.5.1及Canoco 5等完成。

2 結果與分析

2.1 土壤細菌豐度的差異

圖1 不同處理下的細菌豐度 Fig.1 The bacterial abundance in different treatment不同的小寫字母表示有顯著差異(P<0.05)；L：輕微生態(tài)風險水平 Low ecological risk level；M：中等生態(tài)風險水平 Moderate ecological risk level；H：強生態(tài)風險水平 Hight ecological risk level

本研究采用定量PCR來定量所有土壤樣品中細菌群落的DNA拷貝數,用其表征土壤樣品中的細菌豐度(圖1)。隨著RI水平的升高,細菌豐度呈下降的趨勢,CK為最大值(3.79×109)拷貝數/g干土。在相同的RI水平下,Pb污染土壤的細菌豐度均顯著大于Cd污染(P<0.05)。

2.2 土壤細菌碳源利用的差異性

AWCD值可以判斷土壤中細菌群落對碳源的利用能力,是細菌功能性的一項重要指標。隨時間的變化不同處理土壤樣品的AWCD值逐漸增加,在第168 h時各樣品的AWCD值基本達到平臺期,因此采用第168 h的AWCD值進行分析(圖2)。3種生態(tài)風險水平下土壤樣品的AWCD值均小于CK,且隨著RI水平的升高而降低(圖3)。表明重金屬污染會對細菌群落的碳源利用率造成不利的影響。在相同RI水平下,不同重金屬處理之間的AWCD值也表現出顯著差異,無論是輕微、中等還是強風險水平下,Pb污染土壤樣品的AWCD值均顯著大于Cd污染(P<0.05)(圖3)。

功能多樣性指數可以反映土壤細菌群落利用碳源類型的差異性。與AWCD值相似,在所有處理中,CK的功能多樣性指數均為最大(圖4),表明CK土壤細菌種類最多、分布較均勻且對碳源利用程度最高。對比相同RI水平下的Pb污染和Cd污染我們發(fā)現,功能多樣性指數Shannon指數和McIntash指數均存在顯著差異(P<0.05),Pb處理顯著高于Cd處理(P<0.05)。而對于Simpson指數則無顯著差異,表明相同RI水平下不同重金屬處理對土壤細菌群落中的優(yōu)勢種影響不大。

圖2 不同處理下細菌培養(yǎng)過程中平均顏色變化率(AWCD)Fig.2 AWCD changes of bacterial communities in different treatments

圖3 168h平均顏色變化率(AWCD)Fig.3 Average color change rate (AWCD) at 168h

為了更全面的了解不同處理之間細菌對碳源利用率的差異性,將31種碳源分為6類(糖類、羧酸、氨基酸、酯類、醇類和胺類)進行分析比較(圖5)。所有土壤樣品對糖類和羧酸的利用率較高。與CK相比,重金屬污染土壤樣品對6類碳源的利用率均小于CK。在3種相同RI水平下,Pb污染對糖類和羧酸的利用強度均顯著大于Cd污染(P<0.05),而對其余4類碳源的利用強度無明顯差異。

圖5 不同處理下細菌群落的碳源代謝強度Fig.5 The carbon utilization intensity of bacterial communities among different treatmentsRI: 潛在生態(tài)風險指數

2.3 土壤細菌群落代謝功能分析

應用主成分分析,在31個碳源中共提取7個主成分因子(表3),累積貢獻率達到92.27%,從中選取累積貢獻率達到49.40%的前兩個主成分PC1和PC2(特征根分別為9.20和6.11)來分析細菌群落功能的綜合差異和相似狀況。如圖6所示,不同處理在PC軸出現了明顯的分異,在相同RI水平下Pb污染和Cd污染各為一類,可見PC1和PC2能區(qū)分不同處理細菌微生物的群落特征。

考慮到各個主成分反應的變異問題,本研究進一步計算了PC1與PC2的綜合得分(表4)。CK與其余樣品在PC1和PC2上得分系數均表現出顯著差異(P<0.05)。在相同RI水平下,Pb污染和Cd污染在PC1軸上得分系數均表現出顯著差異(P<0.05)。在PC2軸上,只有強危害水平下的Pb污染和Cd污染之間表現出差異性(P<0.05)。從第一主成分和第二主成分的綜合得分來看,不同處理間均有顯著性差異(P<0.05)。表明不同處理土壤樣品中細菌群落具有不同的碳源利用模式。

表3 主成分特征根

表4 不同處理下主成分得分系數

圖6 不同處理下細菌碳源利用特性的主成分分析(PCA) Fig.6 Principal component analysis for carbon utilization of soil bacterial community among different treatments

2.4 土壤細菌群落多樣性及群落結構

對所有土壤樣品的16s rDNA V3—V4可變區(qū)域測序,每個樣品得到29974個序列,以97%相似度劃分,得到4308個OTUs,共30個門,85個綱,230個目,383個科,641個屬和1417個種。

通過Venn圖可以直觀地表現不同土壤樣品中OTUs數目組成的相似性及重疊情況(圖7)。在RI=100時,OTUs數量為L-Pb(2527)>CK(2497)>L-Cd(1356)；RI=200時,CK(2479)>M-Pb(2486)>M-Cd(1711)；RI=400時,CK(2479)>H-Pb(1895)>H-Cd(1496)。除了在RI=100時,L-Pb的OUTs數量大于CK,其他RI水平下CK的OUTs數均為最大,在所有RI水平下Pb污染的OUTs數量均大于Cd污染。同時,圖8的基因多樣性指數ACE指數和Chan1指數也驗證了上述物種豐富度的排名,Pb污染均顯著大于Cd污染(P<0.05)。而在物種多樣性和均勻性上,由Shannon指數可以看出相同RI水平下Pb污染和Cd污染之間無顯著差異。

圖7 不同RI水平下不同處理OTUs的韋恩圖Fig.7 The Venn diagram of OTUs under different treatments at the different RI levels

圖8 不同處理下細菌的基因多樣性指數Fig.8 The gene diversity index of bacteria in different treatments

從細菌群落結構來看,相同RI水平下的Pb污染和Cd污染之間也存在差異性。在門分類水平上,相對豐度大于1%的細菌門共有11個(圖9)。變形菌門(Proteobacteria)為主要菌門,在7組樣品中占比均在42%以上。其他優(yōu)勢菌門分別為放線菌門(Actinobacteria,12.96%—17.76%)、酸桿菌門(Acidobacteria,8.49%—17.94%)和綠彎菌門(Chloroflexi,2.14%—12.87%),大約占總菌數81%以上。在相同RI水平下,Pb污染土壤樣品中變形菌門的相對豐度均小于Cd污染,分別為L-Pb(44.96%)、L-Cd(55.57%)、M-Pb(42.77%)、M-Cd(52.91%)、H-Pb(36.87%)和H-Cd(51.29%)。而綠彎菌門的相對豐度則表現相反的趨勢,Pb污染均大于Cd污染,L-Pb是L-Cd的3.6倍,M-Pb是M-Cd的4.8倍,H-Pb是H-Cd的4.5倍。

圖9 不同處理門水平土壤細菌群落的相對豐度Fig.9 The relative abundance of soil bacterial communities at phylum level in different treatments

將相對豐度前30的屬以熱圖的形式呈現,通過顏色的深淺將數據的大小直觀表現出來(圖10)。變形菌門有14個屬,酸桿菌門有7個屬,放線菌門和綠彎菌門各有3個屬,芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、Patescibacteria和Rokubacteria各有1個屬。在相同RI水平下,大部分屬在Pb處理和Cd處理之間也具有不同的相對豐度,如慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和norank_f__Roseiflexaceae等。

圖10 不同處理屬水平土壤細菌群落的相對豐度Fig.10 The relative abundance of soil bacterial communities at genus level in different treatments

3 討論

細菌對重金屬的脅迫響應有多種方式,如群落數量的減少、功能多樣性的降低以及群落結構的改變等,這些細菌參數通常被用作重金屬污染的指示[15]。Pb、Cd污染土壤樣品中的細菌豐度均小于CK(圖1),并且隨著RI水平的升高,細菌豐度呈下降趨勢。這表明Pb、Cd污染會降低土壤細菌豐度,污染程度越高對細菌豐度的影響越大,這與李勇等人[8]的研究結果相似。在相同RI水平下,Cd污染土壤中的細菌豐度顯著小于Pb污染(P<0.05),表明Cd對細菌豐度的毒害作用大于Pb。這可能是由于Cd對土壤膠體親和力低,移動性很大[16],重金屬對細菌的可利用性大。而Pb在土壤中受各種物理、化學作用的影響,總體上是由不穩(wěn)定態(tài)向穩(wěn)定態(tài)轉變,活性和毒性呈降低趨勢[17]。

AWCD值是反映土壤微生物代謝活性的一個重要指標,AWCD值越大,表明土壤微生物的活性越高,對碳源利用率越高[18]。CK的AWCD值和功能多樣性指數均大于重金屬Pb、Cd污染的土壤,表明土壤重金屬污染會降低細菌的碳源利用率及功能多樣性,Mkhinini等[19]的研究結果也證實了這一點。CK對6大類碳源的利用率均大于Pb、Cd污染的土壤樣品,并且在糖類、羧酸和酯類的利用率上存在顯著差異(P<0.05)。Gremion等[20]研究表明,重金屬污染下的土壤微生物對氨基酸類、胺類以及氨基化合物碳源利用低。張涪平等[21]研究也表明,與對照土壤相比,礦區(qū)土壤受重金屬污染區(qū)的土壤酶活性、基礎呼吸和代謝商均受到了一定程度的抑制。因此對比相同RI水平下Pb污染和Cd污染的AWCD值、Shannon指數和McIntosh指數我們發(fā)現,Cd污染均顯著小于Pb污染(P<0.05),在糖類和羧酸的利用率上存在顯著差異(P<0.05),并且主成分分析結果也表示,Pb污染和Cd污染具有不同的碳源利用模式,這表明Cd對細菌功能多樣性的脅迫作用大于Pb。

土壤中重金屬污染會導致微生物多樣性的下降[22]。除了L-Pb,CK的OTUs值均大于Pb、Cd處理的土壤,Chao1指數和ACE指數隨著RI水平呈下降的趨勢,說明重金屬污染降低細菌多樣性,污染程度的越高對細菌多樣性的影響越大。而L-Pb大于CK可能與中度干擾理論有關,Wakelin等[23]研究表明微生物多樣性最初隨著重金屬濃度的升高而增加,直到達到臨界值后多樣性急劇下降,Jia等[24]研究也得到相似的結果。相同RI水平下,Pb污染的OTUs數和群落豐富度指數(ACE指數和Chao1指數)均大于Cd污染,而Shannon指數無顯著差異(P<0.05),功能多樣性的Simpson指數也表現出相同結果,這表明Cd污染對細菌多樣性的影響大于Pb污染,而對優(yōu)勢種的影響較小。這是由于重金屬污染能降低原有群落的種間競爭關系,具有耐受性的抗性菌種具有更好競爭力而迅速增長成為優(yōu)勢菌種[25],優(yōu)勢菌種可能對Pb和Cd具有相同的耐受性,從而導致優(yōu)勢種無顯著差異。重金屬污染對微生物群落結構產生較顯著的影響,因此我們可以通過對比細菌的相對豐度分析Pb、Cd對細菌群落結構影響的大小。所有土壤樣品中的優(yōu)勢菌門均為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門,這與大部分研究結果相似[26- 27]。相同RI水平下,Pb污染土壤中變形菌門的相對豐度小于Cd污染,而綠彎菌門表現出相反的趨勢,屬水平上不同菌屬也表現出差異性,例如慢生根瘤菌屬在Pb污染中相對豐度均大于Cd污染。相關研究表明變形菌門在重金屬污染土壤中為最豐富菌門,其相對豐度隨重金屬污染程度的升高而增加[26],屬于變形菌門的慢生根瘤菌屬也是在中度和重度重金屬污染土壤中比較豐富[28],對比本研究結果說明相對于Pb污染,Cd的污染程度更高。而綠彎菌門的差異可能是其對Pb、Cd耐受性的不同造成的,安鳳秋等[29]研究表明土壤中綠彎菌門的相對豐度與Pb濃度呈顯著正相關,Feng等[30]研究表明Cd污染土壤中綠彎菌門的相對豐度較低。相同RI水平下細菌群落結構的變化,體現了Pb和Cd對不同細菌菌種的毒性作用不同。騰應等[31]研究也表明在復合重金屬污染的土壤中,Cd對細菌群落結構的毒性影響較為明顯,Pb的影響最小。

本研究結果顯示在相同RI水平下,Pb污染與Cd污染之間的細菌豐度、功能多樣性和群落組成結構存在明顯差異,可見相對于Cd,Pb的TF值可能被高估。Pb與Cu具有相同的TF值(Pb=Cu=5),而在Chen等[32]研究中發(fā)現相同RI水平下,相對于Cd,Cu的TF值可能被低估。因此,在評價重金屬對微生物的生態(tài)風險時,Pb和Cd的TF值應當進行適當的調整。

4 結論

(1)隨著RI水平的升高,Pb污染和Cd污染土壤中細菌的豐度、功能多樣性和群落多樣性呈下降的趨勢。

(2)相同RI水平下,Pb污染土壤中細菌的豐度、AWCD值、Shannon指數、McIntosh指數以及對糖類和羧酸的利用率均顯著大于Cd污染(P<0.05),主成分分析也表明Pb污染和Cd污染具有不同的碳源利用模式。

(3)相同RI水平下,Pb污染土壤中細菌的OTUs數、ACE指數和Chao1指數均大于Cd污染,而兩者之間的Simpson指數無顯著差異(P<0.05)。Pb污染土壤中變形菌門的相對豐度大于Cd污染,綠彎菌門則表現出相反的趨勢,在屬水平上各細菌的相對豐度也表現出差異性,如慢生根瘤菌屬、鞘脂單胞菌屬、鏈霉菌屬和norank_f__Roseiflexaceae等。

(4)Hakanson提出的TF值不適用于重金屬對微生物的生態(tài)風險評價,因此為了更全面評估重金屬的生態(tài)潛在風險,有必要深入研究重金屬對土壤微生物毒性效應特征。