孫陽(yáng)，孫悅，吳勃巖，陶雪蓮，姜德友

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

齊墩果酸(Oleanolic Acid,OA)是五環(huán)三萜類(lèi)化合物，它是一種天然化學(xué)成分，存在于多種植物藥物中[1-3]。中藥復(fù)方貞術(shù)消積湯，由女貞子、夏枯草、白花蛇舌草、莪術(shù)和甘草組成，其中君藥女貞子、臣藥白花蛇舌草和夏枯草均含有齊墩果酸。課題組研究證實(shí)該復(fù)方對(duì)肝癌有抑制作用[4]。文獻(xiàn)報(bào)道，齊墩果酸可以抑制HepG2肝癌、結(jié)腸腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌等細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮抗腫瘤作用[5-8]。課題組前期也開(kāi)展了齊墩果酸在體實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)藥物抑制H22肝癌細(xì)胞增殖，通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]，但由于齊墩果酸不溶于水和油，限制了藥物吸收和生物利用度,本實(shí)驗(yàn)制備齊墩果酸自微乳開(kāi)展離體實(shí)驗(yàn)研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞購(gòu)于武漢博士德生物公司(編號(hào)：CX0296)。

1.2 藥品與試劑

齊墩果酸(美倫生物公司，編號(hào)：MB6817)、順鉑(Sigma公司，編號(hào):MKBV3446V)；蓖麻油(阿拉丁試劑公司，編號(hào)：8001-79-4)、吐溫80(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20140901)、蓖麻油聚氧乙烯醚(麥克林公司，編號(hào)：61791-12-6)、PEG400(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào):20131112)、 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，Sigma公司，編號(hào)：M-2128)；AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天公司，編號(hào)：C1062)；Bcl-2、Bax和GAPDH抗體(Abcam公司，編號(hào)分別為ab182858、ab32503和ab128915)，p-Akt(Ser473)和Akt抗體(CST, 編號(hào)為9272和4060)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

Multiskan MK3酶標(biāo)儀、BDAira流式細(xì)胞儀、EVOS FL Auto倒置熒光顯微鏡、Wiggens磁力攪拌器、MX3000P Real-time PCR儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制備齊墩果酸自微乳

齊墩果酸(OA)與蓖麻油、吐溫80、蓖麻油聚氧乙烯醚、PEG400(20:16:34:30)混合，OA的濃度為30 mg·g-1。將其置于50 ℃水浴中溫和攪拌直至藥物完全溶解，呈白色黏稠液體；同時(shí)制備無(wú)齊墩果酸的空白自微乳。分別取二者加蒸餾水稀釋制成白色和無(wú)色透明微乳液，放置于4 ℃冰箱，2日后觀察無(wú)雜質(zhì)析出,將制備的微乳液濾菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SMMC-7721細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，0.25%胰酶消化，1∶3傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞分組及給藥

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為模型對(duì)照組、齊墩果酸組和順鉑組。藥物與完全培養(yǎng)液混合，齊墩果酸和順鉑的終濃度分別為80 μg·mL-1和15 μg·mL-1，作用時(shí)間均為24 h。

2.4 MTT實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔接種密度為5×104個(gè)，模型對(duì)照組加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng)(無(wú)齊墩果酸)，實(shí)驗(yàn)組分別加入20、40、60、80、100、120、140、160、180 μg·mL-1齊墩果酸自微乳，空白對(duì)照組加入空白自微乳培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩搖勻后，于波長(zhǎng)570 nm處讀取OD值。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-調(diào)零組OD)/(模型對(duì)照組OD-調(diào)零組OD)×100%，每組設(shè)定5個(gè)重復(fù)孔，計(jì)算平均值。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6含量的測(cè)定

Elisa法檢測(cè)IL-6含量。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，離心去除沉淀等雜質(zhì)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每次檢測(cè)均做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的吸光度值在坐標(biāo)上找到對(duì)應(yīng)的濃度。

2.6 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

肝癌細(xì)胞接種于6孔板中，將80 μg·mL-1齊墩果酸和15 μg·mL-1順鉑處理細(xì)胞24 h，用AnnextinV-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒染色，室溫下避光作用10 min，熒光顯微鏡下觀察，AnnexinV-FITC染色陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光，PI染色陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色熒光，未被熒光染色的是正常細(xì)胞，僅為綠色熒光的是早期凋亡細(xì)胞，紅、綠色熒光雙染的是晚期凋亡或壞死細(xì)胞。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡

將齊墩果酸和順鉑作用于6孔板中的肝癌細(xì)胞，24 h后PBS沖洗、胰酶消化收集細(xì)胞，用AnnextinV-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度，F(xiàn)ACSDiva Version6.1軟件分析，比較各組總凋亡率、早期凋亡率和晚期凋亡率。

2.8 細(xì)胞Bax、Bcl-2和Akt mRNA表達(dá)

收集各組細(xì)胞，提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳法分析其完整度。各基因引物分別為：Bax 上游5′-CCCTTTTCTACTTTGCCAGCA-3′，下游5′-GGAGTCTCACCCAACCACCC-3′，150 bp;Bcl-2上游5′-CCCTGTGGATGACTG AGTACCTG-3′，下游5′-GCCGTACAGTTCCACAAAGGC-3′，89 bp;Akt上游5′-ACCTTCCATGTGGAGACTCCTGAG-3′，下游5′-GTCCATCTCCTCCTCCTCCTGC-3′，99 bp;GAPDH上游5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，下游5′-AGTCCTT CCACGATACCAAAGT-3′，113 bp。

2.9 Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，蛋白裂解液作用后收集上清，測(cè)定蛋白濃度。取蛋白20 μg加入上樣緩沖液，95 ℃條件下變性10 min。經(jīng)過(guò)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加入Bax、Bcl-2、Akt(抗體濃度1∶1 000)、p-Akt(抗體濃度1∶300)，GAPDH(抗體使用濃度1∶10 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗后孵育顯影檢測(cè)、分析,重復(fù)3次。

2.10 統(tǒng)計(jì)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 齊墩果酸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

空白對(duì)照組和齊墩果酸組油劑均為透明微黃的油狀液體，將兩種乳化劑加水稀釋后發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組溶液顏色透明并有藍(lán)色乳光，齊墩果酸自微乳水溶液為白色均一液體?？瞻讓?duì)照組與模型對(duì)照組細(xì)胞存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明制備自微乳的輔料對(duì)細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響。不同劑量的齊墩果酸作用肝癌細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率與模型對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著濃度的增加，細(xì)胞的存活率降低，如表1所示。根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)齊墩果酸劑量為80 μg·mL-1。

表1 齊墩果酸對(duì)肝癌細(xì)胞存活率的影響

3.2 齊墩果酸對(duì)肝癌細(xì)胞IL-6的影響

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式Y(jié)=0.008X+0.143(R2=0.953)，X為IL-6濃度，Y為吸光度，計(jì)算各組IL-6的含量(如表2所示)。齊墩果酸和順鉑組IL-6含量均低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與順鉑組相比，齊墩果酸組略低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；結(jié)果說(shuō)明，齊墩果酸和順鉑抑制肝癌細(xì)胞中IL-6的產(chǎn)生。

表2 齊墩果酸對(duì)肝癌細(xì)胞IL-6的含量的影響

3.3 熒光顯微鏡下觀察齊墩果酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法熒光顯微鏡觀察，其中綠色熒光為AnnexinV-FITC染色陽(yáng)性細(xì)胞，僅被綠色熒光染色為凋亡細(xì)胞，未被熒光染色為正常細(xì)胞，綠色和紅色均染色的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。圖1可見(jiàn)模型對(duì)照組細(xì)胞正常細(xì)胞數(shù)量較多，凋亡細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)較少。齊墩果酸組和順鉑組凋亡細(xì)胞較模型對(duì)照組數(shù)量明顯增加，正常細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少。

圖1 熒光顯微鏡觀察肝癌細(xì)胞形態(tài)(100×)

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)齊墩果酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

如表3和圖2所示，與模型對(duì)照組比較，齊墩果酸和順鉑組的晚期凋亡(Q2)率、早期凋亡(Q4)率和總凋亡率明顯增加，差異顯著(P<0.05)；齊墩果酸與順鉑組比較，各指標(biāo)均低于順鉑組，差異顯著(P<0.05)。

圖2 齊墩果酸對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

表3 齊墩果酸對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡率的影響

3.5 細(xì)胞Bax、Bcl-2和Akt mRNA表達(dá)

各組細(xì)胞藥物作用24 h后，與模型對(duì)照組(2-ΔΔCt=1)相比，用藥組Bax mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，順鉑組與齊墩果酸組Bax mRNA差異不顯著(P>0.05)；Bcl-2 和Akt mRNA 表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，順鉑組與齊墩果酸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，齊墩果酸對(duì)Bcl-2 mRNA表達(dá)的抑制作用強(qiáng)于順鉑，如表4所示。

表4 齊墩果酸對(duì)肝癌細(xì)胞Bax、Bcl-2和Akt mRNA相對(duì)表達(dá)

3.6 細(xì)胞Bax、Bcl-2和Akt蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖4，表5所示。與模型對(duì)照組比較，用藥組Bax蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，順鉑與齊墩果酸比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，用藥組Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，齊墩果酸組低于順鉑(P<0.05)；齊墩果酸和順鉑組Akt和p-Akt蛋白表達(dá)下調(diào)，與模型對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；順鉑組Akt和p-Akt蛋白表達(dá)低于與齊墩果酸組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 齊墩果酸對(duì)Bax、Bcl-2、Akt 和p-Akt蛋白表達(dá)的影響

表5 齊墩果酸對(duì)肝癌細(xì)胞Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)的影響

4 討論

肝癌屬于“癥瘕”“積聚”等范疇，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛是正氣虧虛，標(biāo)實(shí)為氣滯、痰濁、濕毒、血瘀相互為患，蘊(yùn)結(jié)于肝致使發(fā)病。中醫(yī)藥多以扶正固本、抑癌攻毒為治法，對(duì)控制腫瘤發(fā)展起重要作用。課題組前期研究的中藥女貞子歸肝、腎經(jīng)，屬于補(bǔ)益類(lèi)中藥，具有扶正固本作用，并且具有免疫調(diào)節(jié)作用。女貞子的有效成分齊墩果酸，在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)通過(guò)影響IL-6細(xì)胞因子，發(fā)揮抗腫瘤作用。IL-6是由淋巴樣和非淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，對(duì)淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞等均有生物學(xué)效應(yīng)。IL-6參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，因此抑制其生成具有重要的意義。IL-6通過(guò)激活酪氨酸蛋白激酶-信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase-signal transducers and activators of transcription,JAK-STAT)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/proteinkinase B,PI3K/Akt)信號(hào)通路發(fā)揮抑制凋亡的作用[10-12]。齊墩果酸和陽(yáng)性對(duì)照藥順鉑均可抑制IL-6產(chǎn)生及Akt基因和蛋白表達(dá)，通過(guò)抑制該信號(hào)通路及其下游基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)屬于Bcl-2家族成員，彼此相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活與凋亡。Bcl-2和Bax 與線粒體途徑的細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。Bcl-2通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜電位、膜通透性，抑制半胱天冬酶活性，結(jié)合細(xì)胞色素C，抑制細(xì)胞凋亡。Bax接收到各種凋亡信號(hào)后，在線粒體膜上形成釋放凋亡因子的孔道，促進(jìn)線粒體膜通透化(MOMP)，細(xì)胞色素C釋放，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。據(jù)報(bào)道，多種中藥和其有效成分可通過(guò)調(diào)控Bcl-2家族基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或自噬，發(fā)揮抗腫瘤的作用[13-14]，亦可負(fù)調(diào)控，避免細(xì)胞凋亡性死亡，起到保護(hù)細(xì)胞的作用[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)齊墩果酸對(duì)肝癌細(xì)胞有抑制作用，通過(guò)上調(diào)Bax基因表達(dá)，下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。齊墩果酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡率低于順鉑組，下調(diào)Akt基因表達(dá)作用弱于順鉑，下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)作用強(qiáng)于順鉑，說(shuō)明藥物抗腫瘤的作用靶點(diǎn)多種，順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還有其他的途徑和信號(hào)通路，各信號(hào)通路之間交叉串話，今后課題組將深入研究藥物抗腫瘤的其他分子機(jī)制。