李旺，邱華，蒙蔭杰，呂超，舒發(fā)明，李媛，毛德文

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

抗病毒是慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)治療的關(guān)鍵，根據(jù)病毒學(xué)與血清學(xué)的應(yīng)答結(jié)果，可分為基礎(chǔ)終點(diǎn)、滿意終點(diǎn)及理想終點(diǎn)3個(gè)階段。循證數(shù)據(jù)顯示，對(duì)于HBeAg陽(yáng)性的CHB而言，達(dá)到HBeAg血清轉(zhuǎn)換預(yù)示著更低的復(fù)發(fā)率，更短的療程及更少的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。而目前核苷(酸)類似物、干擾素等抗病毒藥物在實(shí)現(xiàn)理想目標(biāo)即HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換、滿意目標(biāo)即HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換方面均尚未取得預(yù)期療效。因此，深入探索HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制，構(gòu)建有效的干預(yù)新途徑，提高血清學(xué)轉(zhuǎn)換率是當(dāng)前乙肝抗病毒領(lǐng)域國(guó)際最前沿方向及技術(shù)爭(zhēng)奪的制高點(diǎn)。弗林蛋白酶(Furin)是一種重要的內(nèi)切蛋白酶，屬于前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)urin通過(guò)對(duì)HBeAg前體的切割，參與到HBeAg的成熟過(guò)程[2]，而未切割的HBeAg可以被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外膜上從而觸發(fā)抗病毒免疫反應(yīng)[3]。本課題組前期臨床及體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)白花香蓮解毒顆粒具有促進(jìn)HBeAg和HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的療效，但是其機(jī)制尚未明確[4]。本研究擬通過(guò)觀察白花香蓮解毒顆粒對(duì)HBeAg陽(yáng)性CHB患者血清HBeAg及Furin表達(dá)的影響，以揭示其促進(jìn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在2018年7月—2019年6月期間，收集120例在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科就診的HBeAg陽(yáng)性CHB患者和20例健康人。將120例HBeAg陽(yáng)性CHB患者隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，各60例。其中對(duì)照組男性33例，女性27例，平均年齡(33.24±10.78)歲，HBV DNA載量(6.62±0.63)lg IU/mL，血清中HBeAg滴度(884.76±479.52)S/Co；治療組男性36例，女性24例，平均年齡(35.42±9.88)歲，HBV DNA載量(6.43±0.89)lg IU/mL，血清中HBeAg滴度(926.76±513.18)S/Co。兩組患者性別、平均年齡、HBV DNA載量、HBeAg滴度等基線資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)招募20例健康人作為健康對(duì)照組，其中男、女人數(shù)各10例，平均年齡(30.15±4.38)歲。該研究通過(guò)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批，且參與研究的所有受試者都簽訂了知情同意書(shū)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

HBeAg陽(yáng)性CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015)》[5]中的診斷標(biāo)準(zhǔn),血清HBsAg、HBeAg均為陽(yáng)性，HBV DNA陽(yáng)性，ALT持續(xù)或反復(fù)異?；蚋谓M織學(xué)檢查有炎癥變化。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合HBeAg陽(yáng)性CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②HBV DNA≥2×105，ALT≥2×ULN；③年齡18～65歲；④簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他肝炎病毒，如甲、丙、丁、戊型肝炎；②有艾滋病、肺結(jié)核及梅毒等嚴(yán)重傳染病者；③合并肝細(xì)胞癌、肝性腦病及其他嚴(yán)重的全身性疾病和精神病患者；④孕婦或哺乳期婦女；⑤對(duì)中藥過(guò)敏者。

1.4 治療方法

對(duì)照組：給予恩替卡韋分散片(規(guī)格型號(hào)：0.5 mg×28片，正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20100019)0.5 mg/次，1次/d，定時(shí)空腹口服(餐前或餐后至少2 h)，療程48周。

治療組：在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加白花香蓮解毒顆粒[6],主要成分為白花蛇舌草30 g，三葉香茶菜20 g，黃花倒水蓮15 g，排錢草15 g，14 g/袋，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑中心統(tǒng)一制備,1袋/次，2次/d，早晚飯后沖服，療程48周。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

血清中Furin、HBeAg的測(cè)定：清晨空腹抽取靜脈血5 mL于真空采血管中，將試管樣本放置4 ℃ 3 000 r/min離心20 min，仔細(xì)取上清液，將血清樣品儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱。使用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中Furin、HBeAg水平，結(jié)果均以pg/mL表示。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，質(zhì)控均在范圍內(nèi)。HBV DNA載量的測(cè)定：采用熒光定量PCR法檢測(cè)血清HBV DNA載量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 治療前后各組DNA HBV載量的比較，見(jiàn)表1。

表1 治療前后兩組CHB患者HBV DNA載量的比較

治療前，兩組患者血清中HBV DNA載量對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在12周、24周、48周，兩組患者血清中HBV DNA載量較前均低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組同時(shí)間段比較：治療12、24周后，治療組HBV DNA載量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療48周后，兩組HBV DNA載量相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 兩組HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換比率和HBeAg轉(zhuǎn)陰比率的比較

治療48周，治療組HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和HBeAg轉(zhuǎn)陰率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組CHB患者HBeA血清轉(zhuǎn)換比率和HBeAg轉(zhuǎn)陰比率的比較[例(%)]

2.3 兩組HBeAg滴度水平的比較

治療12周、24周、48周，治療組的HBeAg滴度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組CHB患者HBeAg滴度水平的比較

2.4 治療前后各組血清中Furin含量的比較

治療前，兩組患者血清中Furin含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組患者與健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組在治療12、24、48周時(shí)，F(xiàn)urin的含量均低于治療前，且在24周、48周，治療組Furin含量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組在治療24周、48周后，血清中Furin含量與治療前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 治療前后各組血清中Furin含量

2.5 不良反應(yīng)記錄

治療前后，兩組患者的血常規(guī)、腎功能及心電圖均未見(jiàn)明顯改變，治療組出現(xiàn)1例腹瀉癥狀，予蒙石脫散后，癥狀緩解，之后未出現(xiàn)嚴(yán)重不良事件。

3 討論

臨床上CHB患者，根據(jù)HBeAg陽(yáng)性和陰性表達(dá)不同可分為HBeAg陽(yáng)性CHB、HBeAg陰性CHB，前者由野生型毒株引起發(fā)病，占CHB患者人群的大部分。研究表明，HBeAg陽(yáng)性代表著HBV病毒復(fù)制活躍，進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭及肝癌等重癥肝病的風(fēng)險(xiǎn)更大[7]。而HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換(HBeAg Conversion，HC)，即血清中HBeAg消失，同時(shí)出現(xiàn)能夠識(shí)別HBeAg的T細(xì)胞依賴性中和抗體(e抗體)，其后期因HBV相關(guān)的肝衰竭、肝硬化和HCC發(fā)生率明顯減少，且停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)、生化學(xué)和組織學(xué)突破者顯著下降，被認(rèn)為是抗病毒過(guò)程中的標(biāo)志性轉(zhuǎn)折點(diǎn)。目前抗病毒藥有核苷(酸)類似物和干擾素，它們?cè)谝种艸BV DNA復(fù)制等方面已經(jīng)取得較好的療效，但是在促進(jìn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換這一更具臨床價(jià)值、更迫在眉睫的問(wèn)題尚不夠理想。如恩替卡韋其治療48周HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率僅為21%，3年為24%；替諾福韋治療48周HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為21%，替比夫定治療48周其HBeAg血清轉(zhuǎn)化率為25%～28%，3年可達(dá)42%。即使聚乙二醇干擾素也只能使30%～40%的HBeAg陽(yáng)性CHB患者發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換[8]。從上述數(shù)據(jù)不難看出，要實(shí)現(xiàn)大部分乙肝患者抗病毒治療均能達(dá)到滿意目標(biāo)及理想目標(biāo)仍然任重而道遠(yuǎn)。因此，深入探索HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制，構(gòu)建有效的干預(yù)新途徑，提高血清學(xué)轉(zhuǎn)換率是當(dāng)前乙肝抗病毒領(lǐng)域國(guó)際最前沿方向及技術(shù)爭(zhēng)奪的制高點(diǎn)。其中Furin作為真核生物細(xì)胞中一種重要的內(nèi)切蛋白酶，其通過(guò)識(shí)別特定的氨基酸序列，特異性切割前蛋白中成對(duì)的堿性氨基酸，使前體蛋白獲得生物活性，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和誘發(fā)多種疾病均起重要的作用[9]。Furin對(duì)HBeAg前體成熟為HBeAg發(fā)揮至關(guān)重要作用。HBeAg前體在經(jīng)過(guò)高爾基體時(shí)，需被人蛋白酶Furin切去氨基端的34個(gè)氨基酸殘基才能產(chǎn)生成熟的HBeAg蛋白，分泌到細(xì)胞外，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫耐受而參與慢性HBV感染狀態(tài)的形成和維持[10]，YANG[11]等研究表明恩替卡韋聯(lián)合Furin蛋白抑制劑能顯著地減少HBV復(fù)制和HBeAg生成，這結(jié)論進(jìn)一步證實(shí)下調(diào)Furin蛋白的表達(dá)會(huì)減少HBeAg的生成，有利于促進(jìn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。以Furin蛋白為靶點(diǎn)的促HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換研究日益受到關(guān)注。

中醫(yī)藥是治療CHB的一種重要手段，其在保肝降酶、抗肝纖維化、調(diào)節(jié)免疫及抗病毒等方面具有較好的療效。我國(guó)“十一五”“十二五”多項(xiàng)科技重大傳染病專項(xiàng)從循證醫(yī)學(xué)層面證實(shí)，中醫(yī)藥確能提高HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎或攜帶者的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率，這為破解目前HBV抗病毒治療低HBeAg、HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率的難題提供了一種切實(shí)可行的新途徑。有學(xué)者[12]研究表明中藥聯(lián)合阿德福韋治療HBeAg陽(yáng)性CHB患者48 W時(shí)，HBeAg應(yīng)答率為29.64%，對(duì)照組為17.86%，提高HBeAg應(yīng)答率11.78%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；還有研究[13]表明補(bǔ)腎健脾方治療HBeAg陽(yáng)性HBV攜帶者52 W時(shí)，治療組患者HBeAg均值、HBsAg均值下降均顯著優(yōu)于安慰劑對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

白花香蓮解毒顆粒[14]是在壯醫(yī)“陰陽(yáng)為本，三氣同步”天人自然觀、“谷道水道氣道、龍路火路，三道兩路通調(diào)”生理病理觀和“虛毒致百病”病因病機(jī)觀等核心理論指導(dǎo)下形成的。當(dāng)機(jī)體正氣虛(出現(xiàn)慢性乙型肝炎)，毒邪外侵，藏于咪疊(肝臟)，疏泄失司，蘊(yùn)生諸毒，噓勒(氣血)瘀滯，致“三道”“兩路”阻塞，使“三氣”(天氣、地氣、人氣)不能同步，共而為病的病機(jī)理論。白花香蓮解毒顆粒是本課題組研制的治療慢性乙型肝炎的有效藥物。前期臨床研究表明，白花香蓮解毒顆粒聯(lián)合阿德福韋酯膠囊治療HBeAg陽(yáng)性CHB患者，能顯著提高了HBV DNA 轉(zhuǎn)陰率、生化應(yīng)答率及HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，治療12、24、48周時(shí)，兩組患者血清HBV DNA載量均較治療前顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中治療12、24周，對(duì)照組血清中HBV DNA載量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療48周，對(duì)照組HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和HBeAg轉(zhuǎn)陰率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療24、48周，對(duì)照組血清Furin表達(dá)量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，白花香蓮解毒顆粒聯(lián)合恩替卡韋的方案，能顯著提高達(dá)到滿意終點(diǎn)的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率，其機(jī)制可能與下調(diào)Furin表達(dá)有關(guān)，具有一定的臨床推廣應(yīng)用價(jià)值。