穆 培 丁 歡 許志興 陸雄偉

骨質(zhì)疏松癥是老年人的一個重要健康問題，由于人口老齡化加劇使得該疾病的發(fā)生率呈上升趨勢，診斷和治療仍然具有挑戰(zhàn)性[1]。骨質(zhì)疏松癥分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是最常見的原發(fā)性形式[2]。骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨病，其特征是骨量減少，骨強度降低，骨小梁和皮質(zhì)骨骼微結(jié)構(gòu)惡化，可能導(dǎo)致更高的骨折風(fēng)險[3]。骨的數(shù)量和質(zhì)量在破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細胞介導(dǎo)的骨形成之間保持著動態(tài)平衡[4]。然而，激素缺乏會導(dǎo)致破骨細胞異常激活，破壞骨代謝平衡[5]。

破骨細胞是來源于造血祖細胞的大型多核細胞[6]。在巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和NF-κB受體激活劑(RANKL)的共同作用下，破骨前體細胞分化為成熟的破骨細胞[7]。RANKL是腫瘤壞死因子家族的重要成員之一，通過與RANK相互作用激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)，導(dǎo)致NF-κB通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路等下游信號通路的持續(xù)激活[8]。此外，活化的T細胞胞質(zhì)核因子1(NFATc1)是由C-Fos激活誘導(dǎo)的，導(dǎo)致破骨細胞相關(guān)基因如酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRAP)和組織蛋白酶K(CTSK)的表達增加[9]。目前，臨床上用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物種類繁多，如雙膦酸鹽、地諾舒單抗、特立帕肽和雌激素樣藥物，然而長期服用這些藥物會引起不良反應(yīng)，如乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌[10,11]。

芹甙元又稱芹甙元-7-葡萄糖苷，是從黃芩、五味子、母菊、鐵線菊等中草藥中分離得到的一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗焦慮、抗肥胖等活性[12]。已有研究表明，芹甙元可通過NF-κB信號通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性中耳炎[13]。然而目前還沒有關(guān)于芹甙元作用于破骨細胞的研究。因此，本研究旨在探討體外實驗中芹甙元對破骨細胞形成的影響及其可能的作用機制。

材料與方法

1.實驗材料：芹甙元(芹甙元-7-葡萄糖苷，美國MCE公司)；胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；Trizol試劑(賽默飛世爾科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT及qPCR試劑盒SYBR?PreMix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa生物公司)；巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)(美國R&D System公司)；TRAP染色試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)；一抗(GAPDH、p-NF-κB-p65)及二抗(美國Cell Signalling公司)；4%多聚甲醛、鏈霉素-青霉素、胰蛋白酶消化液、引物(生工生物股份有限公司)。

2.BMMs細胞的獲?。?～6周齡的SPF級C57BL/6J雄性小鼠脫頸處死后用75%乙醇浸泡10min，超凈臺中分離出雙下肢體并剔除肌肉組織得到股骨和脛骨，剪去骨兩端暴露骨髓腔，10cm培養(yǎng)皿中加入含30ng/ml M-CSF的α-MEM完全培養(yǎng)基10ml，1ml注射器吸取培養(yǎng)基沖洗骨髓腔至變白，移液槍輕柔打散血凝塊后培養(yǎng)皿放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于培養(yǎng)第3天半換液，第5天全換液后繼續(xù)培養(yǎng)1天，隨后PBS輕洗后胰蛋白酶消化下貼壁細胞即為所得BMMs細胞，然后用含30ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基重懸用于后續(xù)實驗。

3.CCK-8細胞毒性實驗：為了評價芹甙元對BMMs細胞是否具有細胞毒性作用，將BMMs細胞以8×103個/孔的密度接種于96孔板中，加入完整的α-MEM培養(yǎng)基和M-CSF(30ng/ml)，并增加芹甙元的濃度(0、5、10、15、20、30、40和50μmol/L)。用芹甙元處理后，分別孵育48、72和96h。處理結(jié)束后，每孔加入10μl的CCK-8溶液，37℃避光孵育4h后用酶標儀檢測450nm下的A值。芹甙元對細胞存活率的影響以細胞存活率百分比表示，對照細胞存活率設(shè)為100%。

4.TRAP染色：為了研究芹甙元對破骨生成的影響，將BMMs以1×104個/孔的密度接種于96孔板中。細胞貼壁后分別給予完整的α-MEM、RANKL(50ng/ml)和M-CSF(30ng/ml)刺激破骨細胞分化，同時加入不同濃度的芹甙元(0、 5、10和20μmol/L)。隔天更換一次培養(yǎng)液，直至第5天觀察到破骨細胞的形成，然后將細胞用4%多聚甲醛固定20min，37℃下用TRAP染色液避光染色1h。取細胞核大于3個的TRAP陽性細胞計數(shù)為破骨細胞，用光學(xué)顯微鏡成像，用Image J軟件計數(shù)。

5.RNA提取及qPCR檢測：將BMMs細胞用完全培養(yǎng)基混勻后按3×106個/孔種于6孔板中，待細胞貼壁后加入不同濃度的芹甙元預(yù)處理5天后用Trizol法提取總RNA，隨后用Prime Script RT試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，從RNA模板中獲得cDNA。隨后，使用SYBR?PreMix Ex TaqTMⅡ在ABI7500測序檢測系統(tǒng)上進行實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測。簡而言之，將10μl的SYBR?PreMix Ex TaqTMⅡ、7.2μl的ddH2O、2μl的cDNA和0.4μl的每個引物混合，形成每個PCR的總體積為20μl。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5min，變性95℃ 30s，延伸60℃ 40s，40個循環(huán)，延伸時讀取光度值。以GAPDH作為參照，用2-ΔΔCT法來計算每個基因的相對表達水平，引物序列詳見表1。

表1 目的基因引物序列

6.Western blot法檢測：將BMMs細胞用完全培養(yǎng)基混勻后按3×106個/孔種于6孔板中，待細胞貼壁后加入不同濃度的芹甙元預(yù)處理24h，次日按照0、5、10、20、30、60min倒序加入RANKL使RANKL終濃度為50ng/ml，然后立即用細胞蛋白試劑盒提取各組細胞的蛋白，BCA測定各組蛋白濃度，配置10%分離膠溶液，20微升/孔加入蛋白勻漿，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1h后，一抗按1∶1000用TBST稀釋，4℃封閉過夜。二抗按1∶10000用TBST稀釋后室溫孵育2h，呈像儀曝光。

結(jié) 果

1.芹甙元對BMMs細胞毒性：CCK-8細胞活性測定結(jié)果顯示，當(dāng)濃度達到50μmol/L時，芹甙元對BMMs細胞也無明顯的毒性作用(圖1)。

圖1 CCK-8檢測芹甙元的細胞毒性A.48h細胞相對活性;B.72h細胞相對活性;C.96h細胞相對活性

2.芹甙元對破骨細胞形成的影響：TRAP染色結(jié)果顯示，對照組中可見到體積大、酒紅色、內(nèi)含多個細胞核的破骨細胞。隨著芹甙元的濃度增加，TRAP染色呈陽性的破骨細胞數(shù)目和大小均減少(P<0.05,圖2)。

圖2 TRAP染色下觀察各組細胞培養(yǎng)5天后染色情況(TRAP，×40)A.RANKL+芹甙元0μmol/L;B.RANKL+芹甙元5μmol/L;C.RANKL+芹甙元10μmol/L;D.RANKL+芹甙元20μmol/L;E.TRAP染色陽性破骨細胞數(shù)量統(tǒng)計;F.TRAP染色陽性破骨細胞面積統(tǒng)計。與0μmol/L比較，*P<0.01，**P=0.000

3.芹甙元能夠降低破骨細胞分化基因的表達：qPCR檢測BMMs細胞經(jīng)RANKL和不同濃度的芹甙元培養(yǎng)5天后的破骨細胞基因分化情況，結(jié)果表明隨著芹甙元濃度的升高，破骨細胞分化基因mRNA的表達逐漸降低(P<0.05，圖3)。

圖3 BMMs經(jīng)RANKL和不同濃度的芹甙元誘導(dǎo)后的mRNA表達情況A.NFATC1 mRNA；B.CTSK mRNA；C.C-Fos mRNA；D.Atp6v0d2 mRNA；E.DC-stamp mRNA；F.TRAP mRNA。與0μmol/L比較，*P<0.05, **P<0.01，***P=0.000

4.芹甙元抑制NF-κB通路p65蛋白的磷酸化：Western blot法檢測結(jié)果顯示，20μmol/L的芹甙元預(yù)處理后，磷酸化的p65激活水平相對于對照組有明顯的降低(P<0.05，圖4)。

圖4 Western blot法分析各組BMMs中的NF-κB p65磷酸化情況A.蛋白條帶；B.p-p65相對于GAPDH的統(tǒng)計結(jié)果。與RANKL組比較，*P<0.05, **P=0.000

討 論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥通過降低骨密度和骨面積來降低骨質(zhì)量，這是破骨細胞活性異常的結(jié)果，因此抑制破骨細胞分化是治療骨質(zhì)疏松最重要的策略。破骨細胞是由骨髓的單核-吞噬細胞系分化而來的一種大而多核的細胞，通過在骨吸收區(qū)域分泌H+、Cl-、組織蛋白酶K和基質(zhì)金屬蛋白酶來發(fā)揮降解骨組織的作用[14]。破骨前體細胞的存活需要M-CSF的存在，并可促進其表達基本受體RANK。RANKL是破骨前體細胞向破骨細胞分化必須細胞因子，RANKL與RANK的結(jié)合導(dǎo)致腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)的募集，從而激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38，以及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、激活蛋白1(AP-1)和活化T細胞的核因子-1(NFATC-1)。這些轉(zhuǎn)錄因子的激活通過上調(diào)破骨細胞相關(guān)基因，如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、組織蛋白酶K(CTSK)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和樹突狀細胞特異性跨膜蛋白(DC-stamp)來觸發(fā)破骨細胞分化[15]。

芹甙元是從黃芩、五味子、母菊、鐵線菊等中草藥中分離得到的黃酮類化合[16]。既往研究表明，芹甙元通過在無生物毒性的情況下通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激表現(xiàn)出神經(jīng)保護功能[17]。然而，尚未見芹甙元對破骨細胞的作用報道。本研究發(fā)現(xiàn)芹甙元可以劑量依賴的方式抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞的形成，而無明顯的細胞毒性。同時在20μmol/L的濃度下，幾乎沒有觀察到成熟的破骨細胞形成，提示芹甙元對破骨細胞形成的抑制作用。接著筆者進一步在轉(zhuǎn)錄水平上檢測破骨細胞特異性基因NFATC1、CTSK、Atp6v0d2、TRAP、DC-stamp、C-Fos 等mRNA的表達，結(jié)果進一步證實了芹甙元對破骨細胞形成的抑制作用。

NF-κB是炎癥和免疫反應(yīng)的重要信號介質(zhì)，也是RANKL誘導(dǎo)破骨細胞形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。正常情況下，RANKL與RANK的結(jié)合導(dǎo)致下游的TRAF6的募集并級聯(lián)使IκB磷酸化，使與其結(jié)合的p65釋放并磷酸，緊接著移位到細胞核并誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄[18]。鑒于NF-κB通路在破骨細胞分化中的重要作用，筆者研究在芹甙元是否能夠抑制RANKL誘導(dǎo)的BMMs細胞中NF-κB信號通路的磷酸化水平。在對照組中，當(dāng)細胞加入RANKL刺激后，p65的磷酸化水平升高。而與對照組比較，用芹甙元預(yù)處理過的BMMs細胞，RANKL刺激后其p65磷酸化水平明顯降低，表明芹甙元可通過NF-κB信號通路的激活進而抑制破骨細胞的分化。

因破骨細胞分化過程中的其他通路如MAPKs通路、PI3K/AKT通路也發(fā)揮了重要的作用，本研究未進一步檢測芹甙元對這些通路的是否有影響。同時芹甙元對NF-κB信號通路中TRAF6、IKK、IκB的具體作用靶點及結(jié)合機制未開展進一步研究。這也是本研究存在的不足之處。

綜上所述，本研究證實芹甙元可在無細胞毒性的情況下有效的抑制體外培養(yǎng)的BMMs向破骨細胞分化，這可能是通過NF-κB信號通路來實現(xiàn)的。后續(xù)將進一步探究芹甙元作用于NF-κB及其他信號通路的情況，并在動物水平加以驗證其對破骨細胞抑制作用的效果，明確芹甙元對骨質(zhì)疏松的治療作用，為其作為潛在的治療藥物提供理論依據(jù)。