黃 佳 王琛琛 祝宇銘 郜振國 樊玉娟 馬品江

碘是人體合成甲狀腺激素的必須微量元素。生命早期的神經(jīng)細胞遷移、髓鞘形成和突觸傳遞過程均離不開甲狀腺激素的作用[1～3]。孕期碘缺乏引起的低甲狀腺素血癥可能會導致胎兒不同程度的腦損傷，同時還會增大流產(chǎn)、死產(chǎn)的發(fā)生率[4,5]。反之,孕期過量碘攝入會增加孕婦患甲狀腺疾病尤其是亞甲減的風險，并影響新生兒的甲狀腺功能[6,7]。因此妊娠期間適宜的碘攝入量對母體甲狀腺激素的合成和維護正常胎兒的大腦發(fā)育是必不可少的。本研究通過建立不同碘攝入量的大鼠動物模型，定量評價個體碘營養(yǎng)的狀況，在此基礎(chǔ)上結(jié)合平衡木實驗、鋼絲夾持實驗、轉(zhuǎn)棒實驗、Morris水迷宮實驗，探討母體不同碘攝入水平對子代學習和運動能力的影響。

對象與方法

1.主要儀器與試劑：Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(ZS-001，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司)，疲勞轉(zhuǎn)棒儀(ZB-200，成都泰盟軟件有限公司)，平衡木及鋼絲夾持實驗裝置(課題組自制)，紫外可見分光光度計(UNICO UV-4802型，上海尤尼柯儀器有限公司)，碘化鉀(分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號:20180412)，尿中碘的砷鈰催化分光光度測定方法配套試劑盒(武漢眾生生化技術(shù)有限公司，批號:04202085)，低碘動物飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)。

2.實驗動物：選擇斷乳2周的SPF級Wistar大鼠，雌性150只，雄性50只，大鼠被安置在24±1℃的溫度下，并保持在每天12h光照/12h黑暗中，依次循環(huán)。本次研究所有實驗動物均由新疆實驗動物研究中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(新)2016-0001，實驗在新疆實驗動物研究中心SPF級實驗室內(nèi)進行。

3.實驗動物分組與處理:(1)不同碘攝入水平大鼠模型的建立：雌鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層分為碘缺乏1組(SID組)、碘缺乏2組(MID組)、適碘對照組(NI組)、碘過量1組(MIE組)和碘過量2組(SIE組)，各組均給予低碘動物飼料，低碘動物飼料配制以GB14924.3-2010《實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分》為參考，碘含量為50μg/kg，各組通過飲水加入碘酸鉀使大鼠攝入碘水平達到實驗要求，碘酸鉀濃度依次為0、50、183、2283和11617μg/L，根據(jù)大鼠每日飲食攝入量飼料30g、水30ml，5組大鼠的碘攝入量分別為1.5、3、7、70和350μg/d，干預3個月建立模型[8]。(2)模型判定：干預滿3個月將雌鼠放入代謝籠，收集24h尿液測定尿碘，尿碘采用《尿中碘的測定第一部分：砷鈰催化分光光度測定方法》(WS/T 107.1-2016)進行測定，3組尿碘值依次增高并差異有統(tǒng)計學意義為建模成功。(3)動物處理：3個月后，雌性大鼠與正常雄性大鼠(雄鼠正常飼養(yǎng)條件)交配(雌性∶雄性=3∶1)。陰道塞出現(xiàn)當天被確定為妊娠日第1天(gestational day, GD0)。從GD0到產(chǎn)后(postnatal，PN)第21天(PN21)，懷孕大鼠與孕前喂養(yǎng)條件相同直至生產(chǎn)。子代大鼠在PN14和PN21時每組各取12只(均為雌雄各半)子代大鼠，進行運動能力及行為學測試。

4.運動能力測試：(1)平衡木實驗：在兩個平臺之間放置一個固定在地板上方30cm的長木梁(長100cm，直徑1.5cm)。啟動平臺被照亮，以觸發(fā)大鼠的移動，記錄穿越光束所需的時間。最大潛伏期為120s。(2)鋼絲夾持實驗：每只大鼠的前爪懸掛在離地面上方30cm的鋼絲上(長40cm，直徑2mm)，記錄從鋼絲上掉下來之前的延遲時間。大鼠休息60s進行下次測量，測量2次取平均值。(3)轉(zhuǎn)棒實驗：使用疲勞轉(zhuǎn)棒儀每天對大鼠進行轉(zhuǎn)棒訓練3次，使大鼠在5min內(nèi)基本能夠隨轉(zhuǎn)棒而做相應(yīng)的運動，以10r/min的速度迫使大鼠在棒上運動，記錄其在轉(zhuǎn)棒上的停留時間，測量2次取平均值。

5.Morris水迷宮實驗：實驗分為定位航行階段和空間探索階段:(1)定位航行實驗：將受試大鼠按順時針方向依次自第1、2、3、4象限(除去平臺所在象限)入水點順序放入水中，記錄60s內(nèi)尋找平臺的時間(逃逸潛伏期)，以大鼠逃逸潛伏期的長短來評價大鼠的空間學習能力。(2)空間探索實驗：定位航行實驗全部結(jié)束后，次日進行空間探索實驗，撤去平臺，然后在第1象限相同的入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在60s內(nèi)穿越原平臺區(qū)域的次數(shù)，以及大鼠在平臺各象限停留的時間及游動距離，以此判斷大鼠空間記憶存儲及提取再現(xiàn)的能力。

結(jié) 果

1.不同碘攝入大鼠模型尿碘水平：干預3個月后，5組大鼠尿碘中位數(shù)分別為3.540、51.410、286.801、644.192、2368.701μg/L，詳見表1。隨著飲水碘干預劑量的升高大鼠尿碘中位數(shù)呈倍數(shù)增加，經(jīng)非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗，5組間大鼠尿碘含量比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=94.791，P<0.05)。經(jīng)多重檢驗，各組大鼠與NI組尿碘含量比較差異均有統(tǒng)計學意義(Z=-5.416、-5.416、-5.361、-5.410，P<0.05)。

表1 不同水碘劑量干預組大鼠尿碘水平及比較[M(Q1,Q3)]

2.不同碘攝入水平對子代大鼠運動能力的影響：子代大鼠運動能力測試實驗結(jié)果詳見表2。5個劑量組平衡木通過時間及在平衡木上發(fā)生打滑次數(shù)、在鋼絲上的懸掛時間比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=2.640，χ2=11.873，F(xiàn)=3.178，P<0.05)。5個劑量組轉(zhuǎn)棒持續(xù)時間比較差異無統(tǒng)計學意義(F=0.741，P>0.05)。

3.不同碘攝入水平對子代大鼠學習記憶能力的影響：(1)定位航行實驗：子代大鼠在第2天和第3天各組逃避潛伏期均數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=4.816、8.538，P<0.05)，各劑量組均比適碘對照組長且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。(2)空間探索實驗：各組子代大鼠有效區(qū)域運動時間均比適碘對照組短，且差異有統(tǒng)計學意義(F=3.032，P<0.05)，穿過平臺的次數(shù)也比NI組少且差異有統(tǒng)計學意義(Z1=-2.469，Z2=-2.373，Z4=-2.692，Z5=-3.319，P<0.05，表4)。

表4 不同碘攝入水平對子代大鼠空間搜索時間的影響

討 論

碘是機體必需的微量元素，碘缺乏及碘過量均會影響子代的海馬神經(jīng)元發(fā)育，降低其學習記憶能力[8～10]。既往研究多集中于嚴重的碘缺乏及碘過量，但在實際生活中，這種極端的碘營養(yǎng)狀態(tài)是不常見的，而多見于超出適宜量的輕度碘缺乏及碘過量，該狀態(tài)是否已經(jīng)對機體及子代產(chǎn)生影響存在爭議，需要進一步驗證。

本實驗中按照碘適宜組大鼠碘攝入水平的1/4、1/2、10倍、50倍建立不同碘攝入水平大鼠模型,對其子代大鼠進行運動能力測試時孕期嚴重碘缺乏會導致子代大鼠運動能力降低，輕度缺碘(碘適宜量的1/2倍)、碘適宜量的10倍及50倍可能還未引起子代大鼠的運動能力損傷。本研究測試了出生21天子代大鼠(相當于人的幼兒期)在水迷宮實驗中的學習記憶能力。定位巡航實驗發(fā)現(xiàn)，隨著實驗日的增加，到達平臺的潛伏期明顯縮短，說明子代大鼠在水迷宮實驗中有一定的學習記憶能力。第2天和第3天各劑量組子代大鼠逃避潛伏期時間均比NI組長且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明大鼠的學習記憶能力受到影響，但這也不能完全排除可能是由于缺碘或高碘導致子代大鼠出現(xiàn)甲狀腺功能減退而致心率變慢、代謝減少、行動能力下降，從而逃避潛伏期延長?？臻g探索實驗顯示，SID組和SIE組較NI組有效區(qū)域運動時間短，同時各組穿過目標象限的次數(shù)均比NI組少，均提示孕期不同程度的碘缺乏和碘過量都會對子代學習記憶能力產(chǎn)生影響。

關(guān)于孕期輕度碘缺乏對子代神經(jīng)發(fā)育影響的報道各有差異，也是學者們的研究熱點。本研究提示孕期不同程度碘缺乏對子代學習記憶能力產(chǎn)生一定的影響,同聶珺妍等[11]的研究結(jié)果一致，其中嚴重缺碘組對子代大鼠運動能力產(chǎn)生一定的損傷，但其余各組未發(fā)現(xiàn)明顯的損傷作用。已有大量研究證實，高碘暴露會損害認知功能[12，13]。本實驗中碘過量1組和碘過量2組均未對子代大鼠運動能力有明顯的損傷，但學習記憶能力產(chǎn)生了明顯影響，這可能是由于各研究中定義高碘的碘酸鉀的劑量各不相同，本次研究只能提示超過碘適宜的10倍和50倍的碘攝入劑量未對子代的運動能力產(chǎn)生損傷，但對學習記憶能力產(chǎn)生影響。綜合實驗結(jié)果，碘缺乏和碘過量均會引起不同程度的神經(jīng)發(fā)育障礙，表現(xiàn)為運動能力和學習記憶能力的下降，其中學習記憶能力較為明顯，為孕期碘缺乏和碘過量致子代大鼠神經(jīng)發(fā)育的影響提供了依據(jù)。