周春暉，唐 璐，范 瑞，陽元娥

（1. 廣東輕工職業(yè)技術學院食品生物與技術學院，廣東 廣州 510300；2. 華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

靈芝（Ganoderma lucidum）又稱瑞草、神芝，中醫(yī)藥認為是一種延年益壽，具有良好保健效果的藥用真菌。經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學研究證實，靈芝中含有靈芝多糖、萜類化合物、氨基酸、有機鍺等多種有益于人體健康的天然成分，利用價值極高[1-2]。其中，靈芝多糖作為靈芝的主要次生代謝產(chǎn)物，具有優(yōu)良的藥用和保健價值，在免疫調(diào)節(jié)[3-5]、抗腫瘤[6-8]、抗氧化[9-10]、降血糖[11-12]以及解酒護肝[13-14]等方面具有極高功效，在食品、藥品和化妝品等行業(yè)有著廣闊的應用前景[15-16]。

近年來靈芝消費市場不斷擴大，然而主要多為靈芝孢子粉等初加工產(chǎn)品，深加工產(chǎn)品較少，現(xiàn)有片劑、膠囊、顆粒劑、口服液等，由于其口感不佳或具有不良氣味等原因都存在各自的缺陷[17]。功能性飲料作為新興食品，不僅能夠及時補充人體所需的營養(yǎng)元素，還具備口感風味好，易服用等特點，逐漸成為靈芝深加工的研究熱點[18]。本文以靈芝多糖為主要原料，以具有一定解酒護肝功效的葛根提取物、谷胱甘肽、VC、姜黃素為輔助原料[19-22]，添加白砂糖、檸檬酸、芒果濃縮汁提升產(chǎn)品風味，研發(fā)得到靈芝多糖功能性飲料，并分析其體外抗氧化活性，有效提高靈芝多糖的經(jīng)濟及利用價值，為靈芝多糖的深加工提供一定的科學參考和技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

靈芝孢子粉，廣東元德中藥飲片有限公司；葛根提取物，陜西艾特生物科技有限公司；水溶粉狀姜黃，河南中大恒源生物科技股份有限公司；還原型谷胱甘肽、VC，廣州客源食品配料有限公司；白砂糖、檸檬酸，濰坊英軒實業(yè)有限公司；濃縮芒果汁，漳浦縣達川食品工業(yè)有限公司；芒果香精，深圳市振芯嘉貿(mào)易有限公司；無水乙醇、冰醋酸、硫酸、三氯乙酸、水楊酸，廣州化學試劑廠；纖維素酶，山東隆科特酶制劑有限公司；硫酸亞鐵、過氧化氫、磷酸緩沖液、氯化鐵，天津福晨化學試劑有限公司；鐵氰化鉀，蘇州信清科技有限公司。

1.1.2 設備與設備

101-3AB 型電熱鼓風干燥箱、FW177 中藥材粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；SC-3614 高容量低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海江星儀器有限公司；T6 紫外可見分光光度計，濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；pH-100 筆式酸度計，上海力辰邦西儀器科技有限公司；LH-Q90 型折光儀，杭州陸恒生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 靈芝多糖的提取

參考丁霄霄等[23]的方法并略作修改。精密稱取5 g 靈芝破壁孢子粉殘渣，按照一定料液比溶解于蒸餾水中后添加纖維素酶，混勻，在50 ℃恒溫水浴鍋中酶解90 min，90 ℃下滅酶活并浸提1 h。將粗提液冷卻至室溫后在4 000 r/min 條件下離心10 min，添加無水乙醇醇沉過夜，離心后取沉淀，收集沉淀在60 ℃烘箱中干燥至恒重，得到靈芝多糖。

1.2.2 靈芝多糖功能飲料制備工藝

靈芝多糖功能飲料的制備工藝流程參見圖1。

圖1 靈芝多糖功能飲料制備工藝流程圖Fig.1 Preparation process flow chart of G. lucidum polysaccharide functional beverage

1.2.3 靈芝多糖提取單因素試驗及正交試驗設計

1.2.3.1 料液比的確定

在酶解溫度50 ℃，酶解時間60 min，酶用量3%的條件下，考察不同料液比（1∶25、1∶35、1∶45、1∶55、1∶65（g/mL））對靈芝多糖得率的影響。

1.2.3.2 酶解溫度的確定

在料液比1∶35（g/mL），酶解時間60 min，酶用量3%的條件下，考察不同酶解溫度（25、40、55、70、85 ℃）對靈芝多糖得率的影響。

1.2.3.3 酶解時間的確定

在料液比1∶35（g/mL），酶解溫度50 ℃，酶用量3%的條件下，考察不同酶解時間（25、50、75、100、125 min）對靈芝多糖得率的影響。

1.2.3.4 纖維素酶用量的確定

在料液比1∶35（g/mL），酶解溫度50 ℃，酶解時間60 min 的條件下，考察不同纖維素酶用量（1%、3%、4%、5%）對靈芝多糖得率的影響。

1.2.3.5 正交試驗設計

為獲得靈芝多糖提取的最佳工藝條件，在上述單因素試驗的基礎上，同時考慮降低提取過程中的能耗，以靈芝多糖得率為指標，進行L9(34)正交試驗，試驗因素水平設計如表1 所示。

表1 靈芝多糖提取工藝的正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test for G. lucidum polysaccharide extraction

1.2.4 靈芝多糖功能飲料感官評價方法

取一定量混合均勻的被測樣品置于50 mL 無色透明燒杯中，在自然光下觀察色澤，鑒別氣味，用溫開水漱口，品嘗滋味，檢測其有無異味及異物。以色澤、氣味、口感、液體狀態(tài)等感官指標作為考察標準，根據(jù)表2 進行多指標綜合評分。

表2 感官品質(zhì)評分標準Table 2 Sensory qualities scoring standards

1.2.5 靈芝多糖飲料配方的單因素試驗及正交試驗設計

1.2.5.1 白砂糖添加量的確定

固定靈芝多糖2.5 mg/mL，葛根提取物1%，谷胱甘肽0.1%，VC 0.1%，姜黃素0.03%，芒果濃縮汁5%，檸檬酸0.3%，芒果香精0.02%，考察不同白砂糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%）對靈芝多糖功能飲料感官品質(zhì)的影響。

1.2.5.2 檸檬酸添加量的確定

在“1.2.5.1”配方的基礎上，設置白砂糖添加量為10%，芒果濃縮汁添加量為5%，考察不同檸檬酸添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對靈芝多糖功能飲料感官品質(zhì)的影響。

1.2.5.3 芒果濃縮汁添加量的確定

在“1.2.5.1”配方的基礎上，設置白砂糖添加量為10%，檸檬酸添加量為0.3%，考察不同芒果濃縮汁添加量（1%、3%、5%、7%、9%）對靈芝多糖功能飲料感官品質(zhì)的影響。

1.2.5.4 正交試驗設計

為獲得靈芝多糖功能飲料的最佳感官品質(zhì)，在上述單因素試驗的基礎上，以感官評分為考察指標，進行L9(34)正交試驗，試驗因素與水平如表3 所示。

表3 靈芝多糖功能飲料配方的正交試驗因素與水平表Table 3 Factors and levels table of orthogonal test for G. lucidum polysaccharide functional drink formula 單位：%

1.2.6 靈芝多糖得率的測定

標準曲線繪制：取無水葡萄糖標準品適量，精密稱定，加水制成0.12 mg/mL 的溶液。精密量取標準品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于10 mL 試管中，各加水至2.0 mL，加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL 使溶解，搖勻）6 mL，搖勻，放置15 min 后，置冰浴中冷卻15 min，取出，每組試驗設置3 個平行，以空白組為參比溶液，采用紫外-可見分光光度法于625 nm 處測吸光度，繪制標準曲線。

精密量取供試品溶液2.0 mL，照標準曲線繪制項下的方法，自“加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測定吸光度，根據(jù)標準曲線讀出靈芝多糖濃度，后計算靈芝多糖提取得率。靈芝多糖得率計算公式如下：

式中：W 表示靈芝多糖得率，%；C 表示靈芝多糖濃度，mg/mL；V 表示定容體積，mL；N 表示稀釋倍數(shù)；m表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.7 靈芝多糖功能飲料抗氧化活性研究

1.2.7.1 DPPH 自由基清除能力測定

參照Mccue 等[24]的方法并略作修改。將樣品配制成不同濃度梯度，分別加入1.0 mL 0.2 mmol/L 的DPPH 自由基乙醇溶液和1.0 mL 靈芝提取液，再用95%乙醇定容至100 mL。將制備好的溶液在陰暗處常溫放置30 min。以蒸餾水為空白對照，用可見分光光度計于517 nm 波長處檢測吸光值，計算DPPH 自由基清除率。計算公式如下：

式中：X1表示DPPH 自由基清除率，%；A0表示空白對照的吸光度值；Ai表示加入樣品的吸光度值；Aj表示樣品本身的吸光度值。

1.2.7.2 羥基自由基清除能力測定

參考喬冬等[25]的測定方法，將樣品配制成不同濃度梯度，準確吸取1 mL 樣品溶液，分別加入1 mL FeSO4（6 mmol/L）溶液和H2O2（6 mmol/L）溶液搖勻，靜置10 min，再加入1 mL 水楊酸（6 mmol/L），搖勻后靜置30 min。以蒸餾水為參比，用紫外分光光度計于510 nm 處測吸光度，計算羥基自由基清除率。

式中：X2表示羥基自由基清除率，%；A0表示空白對照吸光度；Ai表示加入樣品液的吸光度值。

1.2.7.3 總還原力測定

參照林捷等[26]的測定方法，采用鐵氰化鉀比色法，在不同濃度樣品溶液中分別加入鐵氰化鉀溶液2.5 mL、0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液2.5 mL，將混合液置于50 ℃水浴中反應30 min，快速冷卻后先后加入2.5 mL 三氯乙酸溶液和0.5 mL 三氯化鐵溶液，用紫外可見分光光度計于700 nm 波長處檢測吸光值。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

試驗中的定量分析進行3 次重復，結果取平均值并計算標準差，采用Origin 9.0 作圖分析，SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 靈芝多糖最佳提取條件分析及確定

如圖2 所示，靈芝多糖得率隨提取劑添加量的增大不斷升高，料液比為1∶65（g/mL）時得率達到最大，為2.39%。而在料液比1∶55（g/mL）后靈芝多糖得率上升趨勢變緩，無顯著性差異；縮小料液比不利于提取能耗的控制，故1∶55（g/mL）可視為最小料液比取值。在酶解溫度55 ℃時，靈芝多糖得率達到最高，而后開始緩慢降低。這可能是由于溫度的升高影響了酶的活性，從而減弱了酶解速率，使多糖得率也逐漸降低。靈芝多糖得率隨酶解時間的延長呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在酶解時間為100 min 時得率最高，為1.89%。隨著酶解時間的不斷升高，原料和纖維素酶也在不斷消耗，在100 min 后酶活性可能開始降低，影響多糖的進一步提取[27]。靈芝多糖得率隨纖維素酶用量的增加呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，這可能是由于隨著酶用量的增多，使酶能夠與底物充分結合，酶解速率升高，靈芝多糖得率提高。繼續(xù)增大酶用量，相對液體量較少，使酶解過程中酶的轉移受到限制，酶解速率降低，多糖含量減少[28]。

圖2 不同酶解條件對靈芝多糖提取得率的影響Fig.2 Effects of different enzymolysis conditions on extraction yields of G. lucidum polysaccharide

在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，優(yōu)化工藝參數(shù)，結果如表4 所示。由數(shù)據(jù)分析可知，酶浸提法提取靈芝多糖中各影響因素大小排序為：A＞D＞C＞B，且最佳理論提取組合為A3B2C1D2，即料液比1∶55（g/mL），酶解溫度50 ℃，酶解時間60 min，纖維素酶用量3%，此時靈芝多糖得率為2.89%。

表4 靈芝多糖提取工藝的L9(34)正交試驗設計及結果Table 4 L9(34) Orthogonal test design and results for extractiontechnology of G. lucidum polysaccharide

2.2 靈芝多糖功能飲料配方的優(yōu)化

由圖3 可以看出，隨著白砂糖添加量的增加，靈芝多糖功能飲料的口感和甜度更符合人們的口味，因而感官評分也隨之增加。當白砂糖添加量超過10%時，口感變?yōu)檩^甜膩，感官評分降低，故白砂糖添加量為10%時最佳。

圖3 白砂糖添加量對靈芝多糖功能飲料感官評分的影響Fig.3 Effects of white sugar additions on sensory scores of G. lucidum polysaccharide functional beverage

檸檬酸作為食品工業(yè)中常用的食品添加劑，可以為飲品帶來獨特的酸性風味并有效保持食品品質(zhì)[29]。由圖4 可見，靈芝多糖功能飲料的感官評分隨檸檬酸添加量的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。檸檬酸添加量較小時，感官評分較低，這是因為檸檬酸濃度較低時無法中和飲料中的澀味，影響口感和風味；而檸檬酸添加量較大時，則飲料過酸。當檸檬酸添加量為0.3%時，靈芝多糖功能飲料的感官評分最高。

圖4 檸檬酸添加量對靈芝多糖功能飲料感官評分的影響Fig.4 Effects of citric acid additions on sensory scores of G. lucidum polysaccharide functional beverage

由圖5 可見，隨著芒果濃縮汁添加量的增加，感官評分呈現(xiàn)先升后降的趨勢。這可能是因為添加量較小時無法掩蓋飲料中藥材的味道，添加量較大又會出現(xiàn)過于濃郁的果汁風味，在芒果濃縮汁添加量為5%時靈芝多糖功能飲料的口感及風味最為合適。

圖5 芒果濃縮汁添加量對靈芝多糖功能飲料感官評分的影響Fig.5 Effects of mango juice concentrate additions on sensory scores of G. lucidum polysaccharide functional beverage

根據(jù)表5 正交試驗分析結果可知，各因素對飲料品質(zhì)和風味的影響主次順序為B＞A＞C，通過正交試驗結果分析可知，靈芝多糖功能飲料最優(yōu)配方組合為A1B2C1，此時飲料的感官評分為86.5 分。

表5 靈芝多糖功能飲料配方的L9(34)正交試驗設計和結果Table 5 L9(34) orthogonal test design and results for G. lucidumpolysaccharide functional beverage formula

2.3 抗氧化活性測定結果

2.3.1 DPPH 自由基清除能力

DPPH·清除率曲線如圖6 所示，對DPPH·的清除能力可以作為靈芝多糖功能飲料抗氧化活性的衡量指標。在本試驗濃度范圍內(nèi)，靈芝多糖功能飲料DPPH·清除率隨樣品濃度的增加而升高，樣品濃度為2.5mg/mL 時，DPPH·清除率達到91.2%，采用SPSS 25.0計算后可得半清除率（IC50）為0.537 mg/mL，說明靈芝多糖功能飲料對DPPH·具有一定清除能力，存在良好的抗氧化活性。

圖6 DPPH·清除率曲線圖Fig.6 Scavenging rates curve on DPPH·

2.3.2 羥基自由基清除能力

人體的免疫反應常常伴隨著羥基自由基的產(chǎn)生，清除體內(nèi)多余的羥基自由基對人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持非常重要[10]。羥基自由基清除率曲線如圖5 所示，靈芝多糖功能飲料的羥基自由基清除率隨樣品濃度的增加呈持續(xù)上升趨勢，在樣品濃度為0.8 mg/mL 后趨于平緩，IC50為0.65 mg/mL。試驗證明靈芝多糖功能飲料能夠有效清除羥基自由基，但清除能力不呈現(xiàn)線性關系。

圖7 羥基自由基清除率曲線圖Fig.7 Scavenging rates curve of hydroxyl radicals

2.3.3 總還原力測定

還原力越強，抗氧化性越強。通過圖8 可以看出，靈芝多糖功能飲料的還原能力隨樣品濃度的增加而增強，還原能力隨著濃度的變化從0.31%增加到1.15%。通過總還原力的測定，可以發(fā)現(xiàn)靈芝多糖功能飲料具有較好的還原能力，結合DPPH·清除力和羥基自由基清除力，進一步說明靈芝多糖功能飲料具有較強的抗氧化作用。

圖8 總還原力曲線圖Fig.8 Curve of total reducing power

3 結論

采用酶浸提法提取靈芝多糖，通過單因素試驗與正交分析，對靈芝多糖提取工藝進行優(yōu)化，當料液比為1∶55（g/mL），酶解溫度為50 ℃，酶解時間為60 min，纖維素酶用量為3%時，靈芝多糖提取得率達最高值2.89%。以靈芝多糖為主要原料，結合單因素試驗和正交試驗，確定靈芝多糖功能飲料的最佳工藝配方為：靈芝多糖含量2.5 mg/mL，葛根提取物1%，白砂糖10%，芒果濃縮汁4%，檸檬酸0.2%，谷胱甘肽0.1%，VC 0.1%，姜黃素0.03%，芒果香精0.02%，該產(chǎn)品顏色呈純正的淺褐色，口感酸甜，爽口清新，具有良好的風味。

通過研究靈芝多糖功能飲料的DPPH·清除率、羥基自由基清除率和總還原力，試驗結果表明，DPPH·清除能力和羥基自由基清除能力的IC50分別為0.537 mg/mL 和0.650 mg/mL，還原能力在濃度為2.5 mg/mL 時達到1.15%，說明靈芝多糖功能飲料具有良好的抗氧化能力。本研究對高效提取靈芝多糖并加工成口感優(yōu)良、服用方便的靈芝多糖功能食品具有一定的參考價值。解酒護肝產(chǎn)品的主要原理在于可以促進乙醇分解，消除肝組織和血漿中的自由基，增強抗氧化能力[30]，后續(xù)可以就該功能飲料在解酒護肝功能及其作用機理方面進行更深入的研究；同時也可以將靈芝多糖在其他保健功能如抗輻射、預防腫瘤等功能食品的開發(fā)與應用上做更廣泛的研究與探討。