鄒茗惠 許薇 薛琪琪 朱志偉 李媛媛 趙金紅

摘要 [目的]通過(guò)形態(tài)和分子特征鑒定玉米象。[方法]從采集到的大米樣本中分離出玉米象，分別在高速度數(shù)碼顯微系統(tǒng)和掃描電鏡下觀察其外部形態(tài)和細(xì)微形態(tài)并進(jìn)行拍照鑒定。同時(shí)提取DNA對(duì)cox1和ITS基因進(jìn)行測(cè)序和分析。[結(jié)果]玉米象的體軀由頭、胸、腹3部分組成，胸部由3個(gè)胸節(jié)組成，有胸足3對(duì)，體表散布密集的刻點(diǎn)。明顯的鑒別特征有頭部的額和頰延伸成象鼻狀的喙，觸角呈膝狀彎曲，共見(jiàn)8個(gè)小節(jié)，口器位于細(xì)長(zhǎng)喙的端部，上唇基本退化，代之為口上片，下顎須和下唇須退化而僵直，外咽片消失。雄蟲(chóng)外生殖器隱藏于腹部，來(lái)源于第9腹節(jié)，陽(yáng)莖背面扁平，有2條平行的縱凹溝，雌蟲(chóng)Y形骨片尖。經(jīng)克隆PCR擴(kuò)增得到cox1、ITS基因片段大小分別為441、1 445 bp，與已報(bào)道的玉米象cox1基因同源性分別為99.7%～100%，ITS基因?yàn)?9.0%～99.3%。[結(jié)論]根據(jù)高速度數(shù)碼顯微系統(tǒng)和電鏡下玉米象的形態(tài)特征，結(jié)合cox1和ITS基因序列分析，可為玉米象的鑒定和生物學(xué)分類(lèi)提供依據(jù)，也可為防治玉米象對(duì)儲(chǔ)糧的危害奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 玉米象;外部形態(tài);分子特征

中圖分類(lèi)號(hào) S 379.5? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）20-0113-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.029

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Morphology Observation and Molecular Characteristics of the Sitophilus zeamais

ZOU Ming-hui，XU Wei，XUE Qi-qi et al （Department of Medical Parasitology，Wannan Medical College，Wuhu，Anhui 241002）

Abstract [Objective]To identify Sitophilus zeamais according to morphology and molecular characteristics.[Method]Sitophilus zeamais were collected from the rice，then observed under an high speed digital microscope system and scanning electron microscope.PCR and walking sequencing were used to obtain cox1 and ITS sequences of the DNA samples extracted from Sitophilus zeamais.[Result]The body of Sitophilus zeamais was composed of three parts： head，chest and abdomen.The chest was composed of three thoracic ganglia，which had three pairs of feet.The distinguishing features were as follows： the forehead and cheek of the head extend into an elephant nose-like beak，the antennae bend knee-like，a total of 8 sections can be seen，the mouth organ is located at the end of the slender beak，the upper lip was basically degenerated，replaced by the upper lip，the mandibular and lower lip whiskers were degenerated and rigid，and the external pharynx slice disappears.The male genitalia was hidden in the abdomen and originates from the 9th abdominal ganglion.The dorsal surface of the male was flat with two parallel longitudinal grooves.The length of ITS and cox1 from the Sitophilus zeamais were 1 445 bp and 441 bp，respectively.Compared with reported Sitophilus zeamais，the homology of cox1 and ITS gene were 99.7%-100% and 99.0%-99.3%，respectively.[Conclusion]The Sitophilus zeamais was identified according to the morphological characteristics under high speed digital microscope system and scanning electron microscope，and the molecular characteristics based on cox1 and ITS genes.It provides a basis for identification and biological classification of Sitophilus zeamais，and also lays a foundation for controlling the harm of Sitophilus zeamais to grain storage.

Key words Sitophilus zeamais;Morphology observation;Molecular characteristics

基金項(xiàng)目 安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（1608085MC77）;安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（gxyqZD2016171）。

作者簡(jiǎn)介

鄒茗惠（1996—），女，江蘇徐州人，碩士研究生，研究方向：病原生物學(xué)。*通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事病原生物的生物學(xué)與生態(tài)學(xué)研究。

鳴? 謝 該研究得到安徽師范大學(xué)生命科學(xué)院電鏡室閆浩老師大力協(xié)助。

收稿日期 2021-01-15;修回日期 2021-02-01

玉米象（Sitophilus zeamais）隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)（Arthropoda）有顎亞門(mén)（Mandibulata）六足總綱（Hexapoda）昆蟲(chóng)綱（Insecta）有翅亞綱（Pterygota）鞘翅目（Coleoptera）象甲科（Curculionidae）谷象屬（Sitophilus），是一種世界性廣泛分布的儲(chǔ)糧害蟲(chóng)[1]。玉米象寄生在禾谷類(lèi)種子上，如蕎麥、花生仁、豆類(lèi)、谷粉、面包等，以成蟲(chóng)啃食或幼蟲(chóng)蛀食的方式危害儲(chǔ)糧，主要危害貯存 2～3 年的陳糧[2]，大量發(fā)生時(shí)可引起儲(chǔ)糧發(fā)熱、霉變和結(jié)塊，造成儲(chǔ)糧的嚴(yán)重?fù)p失，影響儲(chǔ)糧的供給。此外，玉米象的排泄物、遺留的尸體，不僅會(huì)產(chǎn)生難聞的氣味，還會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體有害的物質(zhì)。作為一種重要的儲(chǔ)糧害蟲(chóng)，玉米象的種群危害程度和防治一直是學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)，目前針對(duì)玉米象的研究大多集中在其生態(tài)學(xué)和防治技術(shù)上。形態(tài)鑒別是鑒定玉米象直觀的方法，也是各項(xiàng)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，目前對(duì)于玉米象細(xì)微結(jié)構(gòu)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。分子鑒定是相較于形態(tài)鑒定更為準(zhǔn)確和簡(jiǎn)單的方法，其中細(xì)胞色素氧化酶亞基 I（cytochrome oxidase I，cox1）和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）是鑒定物種較好的分子標(biāo)記。筆者在高速度數(shù)碼顯微系統(tǒng)和掃描電鏡下觀察玉米象的外部形態(tài)和細(xì)微形態(tài)特征，然后對(duì)玉米象的cox1和ITS基因進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析，為玉米象的形態(tài)學(xué)鑒定和生物學(xué)分類(lèi)提供更為豐富的依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步開(kāi)展玉米象的種群遺傳學(xué)研究、物種間系統(tǒng)進(jìn)化及生物防治技術(shù)研究等提供資料。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 高速度數(shù)碼顯微系統(tǒng)（中國(guó) KEYENCE，vw600C型），掃描電子顯微鏡（日本JEOL，JSM-6490LA型），乙醚，無(wú)水乙醇，戊二醛，氫氧化鈉，Taq PCR Master Mix，Proteinase K，DNA Polymerase和DNA marker DL 2000購(gòu)于上海生物工程有限公司。

1.2 樣本采集 玉米象樣本采集于儲(chǔ)存時(shí)間≥1年的大米中。

1.3 方法

1.3.1 高速度數(shù)碼顯微系統(tǒng)標(biāo)本制作。用零號(hào)毛筆從大米樣本中挑出玉米象，用蒸餾水溫和洗滌，置于5%氫氧化鈉溶液中消化數(shù)小時(shí)，然后用蒸餾水漂洗，依次用不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行逐級(jí)梯度脫水，整姿置于載玻片上利用高速度數(shù)碼顯微系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍照。

1.3.2 電鏡樣本制備。將玉米象置于蒸餾水中洗凈，置2.5%戊二醛固定后，依次用不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行逐級(jí)梯度脫水，再用5%醋酸戊酯置換后，將其固定在覆蓋導(dǎo)電雙面膠的電鏡樣品托上，臨界點(diǎn)干燥后在電鏡下（5～10 kV加速電壓）進(jìn)行掃描，拍照并觀察。

1.3.3 DNA提取、引物設(shè)計(jì)和PCR克隆擴(kuò)增。用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取單頭玉米象的基因組DNA。DNA提取結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組DNA質(zhì)量，并用超微量核酸檢測(cè)儀檢測(cè)基因組DNA 濃度，將檢測(cè)合格的基因組 DNA 于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

cox1序列擴(kuò)增引物序列如下[3]：

COIF： 5′-TCTATTCTTGGAGCTATT-3′

COIR： 5′-TAGGGACTGCAATAATTAT-3′

ITS擴(kuò)增引物序列如下[4]：

ITSF：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′

ITSR：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′

引物由通用生物技術(shù)有限公司合成。所用PCR引物見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)總體積為25 μL，含2.5 μL 10×Buffer、2.0? μL MgCl （2.5 mol/L）、1.5 μL dNTPs （2.5 mmol/L aech）、上下游引物（5 μmol/L）各1.0 μL、100 ng模板基因組DNA和1 U Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加無(wú)菌水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳和DNA 膠回收試劑盒純化后，連接到載體pMD19-T上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（DH5α 感受態(tài)細(xì)胞）中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，將陽(yáng)性克隆委托通用生物技術(shù)有限公司采用DNA 測(cè)序儀（ABI-3730）進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3.4 測(cè)序與序列分析。目的條帶測(cè)序工作由通用生物技術(shù)有限公司完成。測(cè)定序列經(jīng)過(guò)DNAMAN（6.0.3.99）軟件拼接，所得序列用DNAStar（V7.10）軟件中的EditSeq編輯，分析其堿基組成，同時(shí)利用DNAStar和DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

2.1.1 玉米象在高速度數(shù)碼顯微系統(tǒng)下的形態(tài)特征。玉米象成蟲(chóng)體長(zhǎng)3.5～5.0 mm，圓筒形，紅褐色，有光澤性。前胸背板前狹后寬，上面布滿圓形刻點(diǎn)。后端約等于鞘翅之寬，背面刻點(diǎn)圓形（圖1A）。腹面可見(jiàn)體軀由頭、胸、腹3部分組成，胸部由3個(gè)胸節(jié)組成，有胸足3對(duì)（圖1B）。頭部額區(qū)向前伸形成啄，頭部?jī)蓚?cè)有復(fù)眼1對(duì)，復(fù)眼由多數(shù)小眼組成（圖1C）。復(fù)眼之間有1對(duì)觸角，觸角呈膝狀彎曲，由8小節(jié)組成（圖1D）。腹部由多個(gè)小節(jié)組成。雄蟲(chóng)外生殖器隱藏于腹部，陽(yáng)莖背面扁平，有2條平行的縱凹溝，雌蟲(chóng)的Y形骨片端部較尖（圖1E、F）。玉米象背面胸腹部被鞘翅所遮擋，鞘翅的基部和端部可見(jiàn)明顯的2對(duì)黃色橢圓形斑紋（圖1G）。3對(duì)足形態(tài)基本相同，足上著生大量刺，最末端著生1對(duì)爪，2爪在基部愈合（圖1H）。

2.1.2 玉米象在掃描電鏡下的形態(tài)特征。

背面觀察玉米象時(shí)僅可見(jiàn)頭部和前胸背板，中胸、后胸和腹部常常被鞘翅所遮蓋，體表散布密集的刻點(diǎn)（圖2A）。

玉米象的體軀由頭、胸、腹3個(gè)部分組成，胸部由3個(gè)胸節(jié)組成，有胸足3對(duì)，其中前胸最為發(fā)達(dá)（圖2B、C）。

頭部的額和頰延伸成象鼻狀的喙，口器著生于喙端，頭部?jī)蓚?cè)有復(fù)眼1對(duì)，呈圓形突出，復(fù)眼由多數(shù)小眼組成，復(fù)眼和額之間有唇基，唇基和額之間由1條彎曲的縫分隔。復(fù)眼之間可見(jiàn)觸角1對(duì)（圖2D）。觸角呈現(xiàn)膝狀彎曲，包括柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)3部分，共可見(jiàn)8個(gè)小節(jié)。其中，柄節(jié)有1節(jié)，呈現(xiàn)棒槌狀，粗長(zhǎng)，與頭部接觸處有凹陷。梗節(jié)1節(jié)，鞭節(jié)可見(jiàn)由6個(gè)亞鞭節(jié)組成，第1～5個(gè)亞鞭節(jié)呈現(xiàn)為套筒狀，每節(jié)都像1個(gè)梯形，從第2節(jié)開(kāi)始逐節(jié)變粗，第6個(gè)鞭節(jié)膨大，整體呈現(xiàn)長(zhǎng)橢圓形，形狀類(lèi)似于毛筆頭，截面近似于圓形，端部密集生長(zhǎng)著多個(gè)感受器（圖2E）。玉米象的口器位于細(xì)長(zhǎng)喙的端部，上唇基本退化，代之為口上片，上顎可見(jiàn)4個(gè)切齒，下顎須和下唇須退化而僵直，不能彎曲，外咽縫合二為一，外咽片消失（圖2F）。胸由前胸、中胸和后胸組成，前胸板呈橫形（寬大于長(zhǎng)），前胸的后部在前足基節(jié)向后突出，嵌入中胸前方的凹陷處，兩側(cè)有溝槽，用以收納觸角（圖2B）。中胸前部窄，部分深入到前胸內(nèi)，后部寬，腹面短，窄于后胸（圖2G、H）。腹部與后胸牢固相連，由10節(jié)組成。雄蟲(chóng)外生殖器隱藏于腹部，來(lái)源于第9腹節(jié)，陽(yáng)莖背面扁平，有2條平行的縱凹溝，是玉米象和其相近米象的主要鑒別特征（圖2I）。每一胸節(jié)腹面有足1對(duì)，稱(chēng)為前足、中足和后足。3對(duì)足中，前足最小，后足最發(fā)達(dá)。足從基部到端部由6部分組成，分別為基節(jié)、轉(zhuǎn)節(jié)、腿節(jié)、脛節(jié)、跗節(jié)和爪。前足的基節(jié)可以活動(dòng)，呈橫臥的圓球形（圖2J）。中足和后足的基節(jié)不明顯，活動(dòng)受限（圖2K、L）。除基節(jié)外，3對(duì)足形態(tài)基本相同，轉(zhuǎn)節(jié)很小，與基節(jié)相連，腿節(jié)和轉(zhuǎn)節(jié)相連，并與轉(zhuǎn)節(jié)一起活動(dòng)。腿節(jié)十分粗壯，伴有刺和齒突。脛節(jié)和腿節(jié)相連，著生大量的刺，跗節(jié)和脛節(jié)相連，由3個(gè)亞節(jié)組成，最末跗節(jié)的端部著生爪1對(duì)，2爪在基部愈合（圖2J、K、L）。

2.2 分子生物學(xué)特征 將提取到的玉米象DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到清晰的cox1和ITS基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物（圖3），克隆擴(kuò)增去掉引物后，所得cox1和ITS基因片段大小分別為441 bp（MW357434）和1 222 bp（MW356870）。

2.3 同源性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析 在GenBank中通過(guò)Blast比對(duì)，下載19種同源性較高的象甲科象蟲(chóng)cox1基因序列（表2），將該研究獲得的玉米象cox1基因片段與GenBank中已報(bào)道到的其他象甲科已知象蟲(chóng)的線粒體DNA cox1 序列片段進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與Corrêa等[5]測(cè)得的3個(gè)玉米象參考序列同源性為100%以外，與其他玉米象cox1基因序列的同源性為97.9%～99.8%。玉米象與其他幾種象蟲(chóng)的同源性為78.2%～88.2%，其中與同屬于谷象屬的米象（Sitophilus oryzae）和谷象（Sitophilus gra-narius同源性最高，均為87.5 %，與北方材小蠹（Anisandrus dispar）為75.1%。同時(shí)將該研究獲得的玉米象cox1基因序列與近屬的幾種象甲科象蟲(chóng)cox1序列以昆蟲(chóng)綱的隆額網(wǎng)翅蝗 （Arcyptera coreana NC 013805.1）為外群，利用DNAMAN分析軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），可見(jiàn)所有的玉米象（Sitophilus zeamais）聚集在同一支，同時(shí)又與米象（Sitophilus oryzae）和谷象（Sitophilus granarius）形成一個(gè)屬的分支。同樣，溝框（Eucryptorrhynchus chinensis）和臭椿溝眶象（Eucryptorrhynchus brandti）聚集在同一支，腎點(diǎn)毛小蠹 （Dryocoetes autographus）和北方材小蠹（Anisandrus dispar）聚集在同一支，17種象蟲(chóng)最終聚集在一起，與隆額網(wǎng)翅蝗 （Arcyptera coreana）分開(kāi)，符合形態(tài)學(xué)同一屬的分類(lèi)。在GenBank中通過(guò)Blast對(duì)，下載8種同源性較高的象甲蟲(chóng)ITS基因序列（表3）。同樣，將該研究獲得的玉米象ITS基因片段與GenBank中已報(bào)道到的其他象甲科已知象蟲(chóng)的ITS序列片段進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與Corrêa等[6]所測(cè)得的5個(gè)玉米象參考序列同源性分別為99.0%和99.3%、99.3%、99.1%、99.1%，和米象（Sitophilus oryzae）ITS序列的同源性為93.3%，與谷象（Sitophilus granarius）ITS序列的同源性為83.1%。同時(shí)將該研究中獲得的玉米象ITS基因序列與另外下載的8個(gè)象甲科象蟲(chóng)ITS序列以松縱坑切梢小蠹蟲(chóng)（Tomicus piniperda AH 011346.2）為外群，利用DNAMAN分析軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5），可見(jiàn)6個(gè)玉米象（Sitophilus zeamais）的ITS序列聚集在同一支，2個(gè)米象（Sitophilus oryzae）的ITS序列聚集在同一支，同時(shí)它們和谷象（Sitophilus granarius）形成一個(gè)屬的分支，并與松縱坑切梢小蠹蟲(chóng)（Tomicus piniperda）分開(kāi)。

3 討論

玉米象是儲(chǔ)糧的頭號(hào)大害蟲(chóng)，對(duì)多種谷物和其加工物均能造成嚴(yán)重危害，在我國(guó)各省區(qū)和大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)皆有廣泛分布。玉米象成蟲(chóng)喜陰暗，趨溫、趨濕，具有假死性。耐寒力、耐饑力和產(chǎn)卵力都較強(qiáng)，發(fā)育速度快。成蟲(chóng)食害禾谷類(lèi)種子，以及面粉、油料、藥材等倉(cāng)儲(chǔ)物，其中小麥、玉米、糙米及高粱受害最重;幼蟲(chóng)則只在禾谷類(lèi)種子內(nèi)為害。

目前對(duì)玉米象整體的形態(tài)和細(xì)微形態(tài)特征的研究尚不夠全面。張生芳[10]直接在光鏡下觀察玉米象形態(tài)，并對(duì)玉米象的整體形態(tài)進(jìn)行了簡(jiǎn)單概括，提出玉米象和米象形態(tài)十分相似，僅僅可以根據(jù)外生殖器的形態(tài)差別來(lái)鑒別2種象蟲(chóng)。陳帆[11]利用掃描電子顯微鏡對(duì)玉米象成蟲(chóng)口器的細(xì)微形態(tài)進(jìn)行了分析并與其他幾種甲蟲(chóng)進(jìn)行比較。數(shù)碼顯微系統(tǒng)對(duì)玉米象進(jìn)行整體觀察簡(jiǎn)單直接，可以清楚了解玉米象的外部形態(tài)整體特征，但標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)不易被觀察，借助掃描電鏡則可以清晰地觀察玉米象的細(xì)微結(jié)構(gòu)特征。該研究結(jié)合掃描電鏡和高速度數(shù)碼顯微系統(tǒng)的觀察，系統(tǒng)描述了玉米象的形態(tài)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高速度數(shù)碼顯微系統(tǒng)的觀察下，玉米象的形態(tài)與其他研究基本相同，而在掃描電鏡下可清晰地觀察到形態(tài)的主要鑒別特征：①頭部：頭部?jī)蓚?cè)有復(fù)眼1對(duì)，呈圓形突出，復(fù)眼和額之間有唇基，唇基和額之間有1條彎曲的縫分隔。②觸角：觸角呈現(xiàn)膝狀彎曲，包括柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)3部分，共可8個(gè)小節(jié)。其中，柄節(jié)有1節(jié)，梗節(jié)1節(jié)，鞭節(jié)可見(jiàn)由6個(gè)亞鞭節(jié)組成。③口器：口器位于細(xì)長(zhǎng)喙的端部，上唇基本退化，代之為口上片，上顎可見(jiàn)4個(gè)切齒，下顎須和下唇須退化而僵直，不能彎曲，外咽縫合二為一，外咽片消失。④外生殖器：雄蟲(chóng)外生殖器隱藏于腹部，來(lái)源于第9腹節(jié)，陽(yáng)莖背面扁平，有2條平行的縱凹溝。雌蟲(chóng)的Y形骨片端部較尖。該研究通過(guò)高速度數(shù)碼顯微系統(tǒng)和掃描電鏡結(jié)合觀察玉米象這些形態(tài)特征，豐富了玉米象的形態(tài)鑒定、分類(lèi)等科學(xué)資料，為玉米象的控制和防治提供了有益的參考。

如其他學(xué)者的研究表明，玉米象和其同屬的米象在形態(tài)上難以鑒別，僅僅可以依靠外生殖器的形態(tài)差別進(jìn)行鑒別，而分子鑒定則可以補(bǔ)充玉米象的形態(tài)學(xué)鑒定。分子鑒定最常用的2個(gè)分子標(biāo)記為cox1和ITS，它們?cè)趧?dòng)物分子鑒定以及系統(tǒng)重建過(guò)程中具有重要意義。楊瑞生等[12]克隆了3個(gè)橡實(shí)象蟲(chóng)cox1基因約556 bp的片段，并與其他24種昆蟲(chóng)的同源片段進(jìn)行分析，研究表明利用cox1基因序列可以明顯地鑒定出橡實(shí)象蟲(chóng)。王桂花[13]通過(guò)微衛(wèi)星（SSR）和線粒體cox1基因分析了福建省12個(gè)紅棕象甲地理種群的遺傳差異，更深入地了解紅棕象甲的入侵及擴(kuò)散范圍，為紅棕象甲的入侵途徑和不同地理種群的防控提供理論基礎(chǔ)。該研究成功獲得玉米象的cox1序列片段，同時(shí)對(duì)已知10余種象甲科象蟲(chóng)的cox1序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)所測(cè)得的玉米象cox1序列和大部分已知的玉米象參考序列同源性為100%，與在巴西和墨西哥測(cè)得的玉米象參考序列具有略微差異，可能是由于地理差距導(dǎo)致。玉米象與其他象蟲(chóng)的同源性為75.1%～87.5%，將幾種象蟲(chóng)的cox1序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)象甲科這幾種象蟲(chóng)具有一定的親緣關(guān)系，同時(shí)明確可見(jiàn)玉米象和米象、谷象親緣關(guān)系最近，同形態(tài)學(xué)的鑒定分類(lèi)結(jié)果一致。ITS是對(duì)昆蟲(chóng)進(jìn)行發(fā)育研究常應(yīng)用的核基因。真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18S rDNA和5.8S rDNA 4 種，它們?cè)谌旧w上頭尾相連、串聯(lián)排列，相互之間由間隔區(qū)分隔。其中18S、5.8S和28SrDNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，三者高度保守，適合較高等級(jí)水平生物群體間的系統(tǒng)分析。該研究成功獲得玉米象的ITS基因序列。同樣，同源性分析發(fā)現(xiàn)所測(cè)得的玉米象與已知玉米象的ITS序列有略微差異，可能是來(lái)自安徽和中國(guó)臺(tái)灣、巴西的地理差異，Corrêa等[5]測(cè)得的4個(gè)巴西的玉米象ITS序列彼此之間也有略有差異，可能來(lái)自個(gè)體的差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)玉米象和谷象、米象ITS序列的同源為83.1%和93.3%，表明ITS可以作為種間鑒定的依據(jù)。將幾種象蟲(chóng)的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，明確可見(jiàn)玉米象和米象、谷象可以聚集在同一屬，同形態(tài)學(xué)的鑒定分類(lèi)結(jié)果一致。該研究測(cè)定了玉米象核基因ITS、線粒體基因cox1基因序列，可作為探討玉米象及其與其他象蟲(chóng)種間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的分子標(biāo)記，同時(shí)可以為玉米象的防治研究提供分子基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]

蔣富友，陳陽(yáng)琴，夏莉，等.淺析玉米象的發(fā)生與防治技術(shù)[J].農(nóng)技服務(wù)，2016，33（4）：135.

[2] 鄭旭，范錦勝，張李香.玉米象生物生態(tài)學(xué)及防治技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（4）：221-225.

[3] OJO J A，VALERO M C，SUN W L，et al.Comparison of full mitochondrial genomes for the rice weevil，Sitophilus oryzae and the maize weevil，Sitophilus zeamais （Coleoptera： Curculionidae）[J].Agri Gene，2016，2：29-37.

[4] GASSER R B，ROSSI L，ZHU X Q.Identification of Nematodirus species （Nematoda： Molineidae） from wild ruminants in Italy using ribosomal DNA markers[J].Int J Parasitol，1999，29（11）：1809-1817.

[5] CORRA A S，VINSON C C，BRAGA L S，et al.Ancient origin and recent range expansion of the maize weevil Sitophilus zeamais，and its genealogical relationship to the rice weevil S.oryzae[J].Bull Entomol Res，2017，107（1）：9-20.

[6] CORRA A S，TOM H V V，BRAGA L S，et al.Are mitochondrial lineages，mitochondrial lysis and respiration rate associated with phosphine susceptibility in the maize weevil Sitophilus zeamais？[J].Ann Appl Biol，2014，165（1）： 137-146.

[7] MOCK K E，BENTZ B J，ONEILL E M，et al.Landscape-scale genetic variation in a forest outbreak species，the mountain pine beetle （Dendroctonus ponderosae）[J].Mol Ecol，2007，16（3）：553-568.

[8] NAN X N，WEI C，HE H.The complete mitogenome of Eucryptorrhynchus brandti （Harold） （Insecta： Coleoptera： Curculionidae）[J].Mitochondrial DNA Part A：DNA Mapp Seq Anal，2016，27（3）：2060-2061.

[9] CABRERA-BRANDT M A，GAITN-ESPITIA J D.Phylogenetic analysis of the complete mitogenome sequence of the raspberry weevil，Aegorhinus superciliosus （Coleoptera： Curculionidae），supports monophyly of the tribe Aterpini[J].Gene，2015，571（2）：205-211.

[10] 張生芳.中國(guó)儲(chǔ)藏物甲蟲(chóng)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，1998：93-94.

[11] 陳帆.5種儲(chǔ)糧甲蟲(chóng)口器的超微形態(tài)和感器的研究[D] .楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

[12] 楊瑞生，鐘亮，姜義仁，等.橡實(shí)象蟲(chóng)等25種昆蟲(chóng)線粒體COⅠ基因的遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化分析[J].蠶業(yè)科學(xué)，201 37（6）：985-992.

[13] 王桂花.基于微衛(wèi)星和線粒體COI的紅棕象甲不同地理種群遺傳結(jié)構(gòu)[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2014.