張明君 戶(hù)沙沙 姜偉偉 李艷 孫桂金

摘要 [目的]研究鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和磷酸三苯酯（TPP）單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響。[方法]將受精后4 hpf（hour post-fertilization，hpf）斑馬魚(yú)胚胎分別暴露于DBP（0、0.5和1.0 mg/L）、TPP（0和0.5 mg/L）和TPP+DBP（0.5 mg/L+0.5 mg/L和0.5 mg/L+1.0 mg/L），統(tǒng)計(jì)72 hpf胚胎孵化率以及96 hpf仔魚(yú)存活率、孵化率、畸形率和體長(zhǎng)。[結(jié)果]DBP和TPP單獨(dú)及聯(lián)合暴露引起斑馬魚(yú)卵黃囊腫、心臟畸形、脊柱彎曲和尾巴畸形，導(dǎo)致斑馬魚(yú)孵化率和存活率下降、畸形率增加和體長(zhǎng)縮短。[結(jié)論]DBP和TPP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚(yú)存活率、畸形率和體長(zhǎng)影響存在交互作用，對(duì)孵化率的影響無(wú)交互作用。

關(guān)鍵詞 DBP;TPP;聯(lián)合暴露;斑馬魚(yú)胚胎;發(fā)育

中圖分類(lèi)號(hào) S 917.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）20-0105-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.027

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effect of Combined Exposure to DBP and TPP on the Development of Zebrafish （Danio rerio） Embryos

ZHANG Ming-jun，HU Sha-sha，JIANG Wei-wei et al （School of Food Science and Engineering，Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences），Jinan，Shandong 250000）

Abstract [Objective]To study the effect of individual and combined exposure to dinbutyl phthalate （DBP） and triphenyl phosphate （TPP） on the development of zebrafish embryos.[Method]Zebrafish embryos at 4 hpf（hour post-fertilization，hpf） were exposed to DBP （0，0.5 mg/L and 1.0 mg/L），TPP （0 and 0.5 mg/L） and TPP+DBP （0.5 mg/L+0.5 mg/L and 0.5 mg/L+1.0 mg/L）.The hatching rate of zebrafish embryos was recorded at 72 hpf，and the survival rate，hatching rate，malformation rate and body length of zebrafish larvae were recorded at 96 hpf.[Result]Exposure to individual and combined of DBP and TPP resulted in obvoius malformations in zebrafish，including yolk-sac edema，cardiac deformities，spinal curvature and tail malformation，decreased hatching and survival rates，increased malformation rate and reduced body length in zebrafish embryos.[Conclusion]It has an interaction effect on the survival rate，malformation rate and body length of zebrafish，and no interaction on the hatching rate of zebrafish.

Key words DBP;TPP;Combined exposure;Zebrafish embryos;Development

基金項(xiàng)目 國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201910431048）。

作者簡(jiǎn)介 張明君（1997—），男，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事食品毒理學(xué)研究。

收稿日期 2021-05-30

鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物（phthalates，PAEs）由于具有軟化塑料和增強(qiáng)塑料彈性的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品包裝、醫(yī)療器械、個(gè)人護(hù)理用品、玩具、清潔劑、潤(rùn)滑油等，是一類(lèi)生產(chǎn)量大的人工合成化合物，是目前全球最常用的塑化劑。隨著時(shí)間的推移，PAEs不斷釋放至環(huán)境，空氣、土壤和水均受到 PAEs的污染[1-2]。人體血液、尿液和母乳等體液也檢出了PAEs及其代謝物[3-4]。PAEs及其代謝物不僅具有生殖和發(fā)育毒性，而且存在致癌、致畸、致突變的潛在毒性，嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康[5-6]。阻燃劑是一類(lèi)能夠防止材料被引燃或者抑制火焰?zhèn)鞑サ闹鷦捎阡宕枞紕┰诃h(huán)境中具有持久性、生物蓄積性等特點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)被逐步禁用。有機(jī)磷阻燃劑（organophosphate flame retardants，OPFRs）價(jià)格較便宜，并具有良好的阻燃效果，且兼有增塑等功能，在紡織、化工、建材和電子等行業(yè)廣泛應(yīng)用，水、大氣、土壤及生物體均受到OPFRs的污染[7]。人體尿液、血漿、頭發(fā)、母乳等人體樣本中也檢測(cè)出了OPFRs[8-9]。OPFRs具有發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、心臟毒性、肝臟毒性等[7，10]，給生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康造成潛在威脅。 PAEs和OPFRs在環(huán)境中同時(shí)存在，人類(lèi)面臨同時(shí)暴露PAEs和OPFRs的風(fēng)險(xiǎn)。單獨(dú)評(píng)價(jià)PAEs和OPFRs毒性作用不能反映它們?cè)诃h(huán)境中的真實(shí)毒性效應(yīng)，而聯(lián)合毒性作用的研究更有助于客觀(guān)地評(píng)價(jià)它們?cè)诃h(huán)境中的真實(shí)毒性效應(yīng)，目前關(guān)于兩者聯(lián)合毒性作用的研究數(shù)據(jù)仍較為有限。

鄰苯二甲酸二丁酯（dinbutyl phthalate，DBP）是目前使用最普遍的PAEs之一，大氣、水體、土壤和生物體中均發(fā)現(xiàn)了它的存在[11-12]。磷酸三苯酯（triphenyl phosphate，TPP）是典型的 OPFRs 之一，生產(chǎn)和需求量都相當(dāng)高，在多種環(huán)境介質(zhì)以及生物體內(nèi)均有檢出[13-15]。研究者已對(duì)DBP和TPP的單一毒性進(jìn)行了深入研究[11-15]，而兩者聯(lián)合毒性作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。斑馬魚(yú)是一種常見(jiàn)的熱帶淡水魚(yú)，具有體型小、飼養(yǎng)管理容易、飼養(yǎng)成本低、體外受精和發(fā)育、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎透明、基因組與人類(lèi)基因組有高度的同源性等特點(diǎn)，已成為繼小白鼠后的第二大模式生物，廣泛應(yīng)用于發(fā)育學(xué)、毒理學(xué)和疾病研究中[16]。該研究以斑馬魚(yú)胚胎作為受試對(duì)象，探討DBP和TPP單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)其發(fā)育的影響，可為PAEs和OPFRs聯(lián)合毒性的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑? DBP（CAS 號(hào)：8474- 純度99%）、TPP （CAS號(hào)：115-86-6，純度≥99%）均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。DBP和TPP溶解于DMSO配制成儲(chǔ)液，4 ℃ 保存。苯硫脲（phenylthiourea，PTU，CAS號(hào)：103-85-5，純度≥98%）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司;DMSO、NaCl、KCl、CaCl2、NaHCO3 均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚(yú)胚胎收集。試驗(yàn)用AB品系斑馬魚(yú)，購(gòu)自上海費(fèi)曦生物科技有限公司，參照《The Zebrafish Book》[17]對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行飼養(yǎng)和繁殖。試驗(yàn)前1 d晚上按雌雄1∶2比例將成年斑馬魚(yú)放入排卵缸內(nèi)，并將雌雄斑馬魚(yú)用隔板分開(kāi)。第2天早上拆除隔板進(jìn)行光照，光照 1 h 后在顯微鏡下觀(guān)察挑選發(fā)育正常的胚胎放入培養(yǎng)液（3.5 g/L NaCl、0.5 g/L KCl、0.1 g/L CaCl2、0.025 g/L NaHCO3）中培養(yǎng)至4 hpf（hour post fertilization，hpf），用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)分為6組，每個(gè)試驗(yàn)組 DMSO 含量0.001%（體積分?jǐn)?shù)），各試驗(yàn)組的暴露劑量見(jiàn)表1。

1.2.3 DBP和TPP單獨(dú)及聯(lián)合暴露。

挑選健康4 hpf 的斑馬魚(yú)胚胎隨機(jī)放入試驗(yàn)組，每組35個(gè)胚胎。選用玻璃培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿放入暴露液5 mL，每皿35個(gè)胚胎，恒溫光控培養(yǎng)箱中（溫度控制在28 ℃，光照/黑暗周期14 h/10 h）培養(yǎng)。24 hpf 后斑馬魚(yú)胚胎暴露液中加入0.003% PTU抑制黑色素生長(zhǎng)，每天更換暴露液，并棄去死亡的胚胎，連續(xù)培養(yǎng)至96 hpf，試驗(yàn)重復(fù) 3 次。觀(guān)察并記錄各組96 hpf斑馬魚(yú)表型，72 和96 hpf 斑馬魚(yú)孵化數(shù)，96 hpf 斑馬魚(yú)存活數(shù)、畸形數(shù)和體長(zhǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），顯著性檢驗(yàn)通過(guò)LSD（Fishers least significant difference）法比較，所有結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD），P<0.05 為顯著性差異。析因設(shè)計(jì)方差分析判斷是否存在交互作用，P<0.05 表示存在交互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 DBP和TPP單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)存活率的影響

從圖1可以看出，與對(duì)照組相比，DBP和TPP單獨(dú)及聯(lián)合暴露均顯著降低斑馬魚(yú)仔魚(yú)存活率;與DBP 組相比，DBP和TPP聯(lián)合暴露顯著降低斑馬魚(yú)仔魚(yú)的存活率;與TPP組相比，TPP+DBP-H 組斑馬魚(yú)仔魚(yú)的存活率顯著降低。雙因素方差分析表明，DBP和 TPP 聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)存活率的影響存在交互作用。

2.2 DBP和TPP單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚(yú)孵化率的影響

從DBP和TPP單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎和仔魚(yú)孵化率的影響（圖2、3）可以看出，與對(duì)照組相比，DBP-H及TPP+DBP-H組72 hpf 斑馬魚(yú)胚胎的孵化率顯著降低;與TPP組相比，TPP+DBP-H組胚胎的孵化率顯著降低。與對(duì)照組相比，TPP+DBP-H組 96 hpf 斑馬魚(yú)仔魚(yú)的孵化率顯著降低;與TPP組相比，TPP+DBP-H組 96 hpf 斑馬魚(yú)仔魚(yú)的孵化率顯著降低。雙因素方差分析表明，DBP和TPP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)孵化率的影響無(wú)交互作用。

2.3 DBP和TPP單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)致畸效應(yīng)的影響 DBP和TPP 單獨(dú)暴露均引起斑馬魚(yú)卵黃囊腫、心包水腫、脊柱彎曲和尾巴畸形，這與前人的研究結(jié)果相同[18-20]。DBP和TPP聯(lián)合暴露引起的斑馬魚(yú)毒性表型與DBP和TPP 單獨(dú)暴露引起的斑馬魚(yú)毒性表型相同。從圖4可以看出，與對(duì)照組相比，DBP和TPP單獨(dú)及聯(lián)合暴露組（0.5 mg/L DBP除外）斑馬魚(yú)仔魚(yú)畸形率顯著增加;與DBP組相比，DBP和TPP聯(lián)合暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)仔魚(yú)畸形率顯著增高;與TPP組相比，DBP和TPP聯(lián)合暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)仔魚(yú)畸形率顯著增高。雙因素方差分析表明，DBP 和 TPP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)畸形率的影響存在交互作用。

2.4 DBP和 TPP單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)體長(zhǎng)的影響

從圖5可以看出，與對(duì)照組相比，DBP-H及DBP和TPP聯(lián)合暴露顯著降低斑馬魚(yú)仔魚(yú)體長(zhǎng);與DBP組相比，TPP和DBP聯(lián)合暴露顯著降低斑馬魚(yú)仔魚(yú)體長(zhǎng);與TPP組相比，TPP+DBP-H組斑馬魚(yú)仔魚(yú)體長(zhǎng)顯著降低。雙因素方差分析表明，DBP和 TPP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)體長(zhǎng)的影響有交互作用。

3 討論與結(jié)論

我國(guó)的大氣、土壤和水源都受到了不同程度的污染，環(huán)境污染已經(jīng)達(dá)到非常嚴(yán)重程度。為保護(hù)人類(lèi)健康，各國(guó)科學(xué)家已經(jīng)對(duì)環(huán)境污染物進(jìn)行了一系列研究，以前的大多數(shù)研究主要集中在單一毒性效應(yīng)，聯(lián)合毒性效應(yīng)研究較少。而在實(shí)際環(huán)境中，環(huán)境污染物均以混合物的形式存在，污染物聯(lián)合毒性的評(píng)估在理論和應(yīng)用方面都具有越來(lái)越重要的科學(xué)意義和實(shí)際價(jià)值。2013年，美國(guó)NIEHS就指出應(yīng)以闡明環(huán)境混合物的健康效應(yīng)作為其未來(lái)優(yōu)先研究重點(diǎn)之一[21]。聯(lián)合毒性作用的研究是當(dāng)前環(huán)境毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，開(kāi)展環(huán)境污染物的聯(lián)合毒性研究可為其健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和管理提供更加可靠的科學(xué)依據(jù)。

人類(lèi)面臨同時(shí)暴露鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物（PAEs）和有機(jī)磷阻燃劑（OPFRs）的風(fēng)險(xiǎn)，評(píng)價(jià)這兩類(lèi)化合物的聯(lián)合毒性作用對(duì)人類(lèi)健康的影響具有重要的意義。DBP和TPP是這兩類(lèi)化合物中典型的污染物，目前有關(guān)兩者聯(lián)合毒性作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。該研究以斑馬魚(yú)胚胎作為受試對(duì)象，探討DBP和TPP單獨(dú)和聯(lián)合暴露對(duì)發(fā)育的影響，結(jié)果表明DBP和TPP 單獨(dú)暴露引起斑馬魚(yú)畸形，導(dǎo)致斑馬魚(yú)孵化率和存活率下降、畸形率增加和體長(zhǎng)縮短，這與前人的研究結(jié)果一致[18-20];DBP和TPP聯(lián)合暴露引起毒性表型與DBP和TPP 單獨(dú)暴露引起的毒性表型相同，DBP和 TPP聯(lián)合暴露也導(dǎo)致斑馬魚(yú)孵化率和存活率下降、畸形率增加和體長(zhǎng)縮短。由此可見(jiàn)，DBP和TPP單獨(dú)及聯(lián)合暴露均影響斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育。DBP和 TPP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)存活率、畸形率和體長(zhǎng)影響存在交互作用，對(duì)胚胎和仔魚(yú)孵化率的影響無(wú)交互作用。該研究結(jié)果對(duì)PAEs和OPFRs聯(lián)合暴露的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)具有重要意義，為這類(lèi)物質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)管理提供有效的毒理學(xué)依據(jù)，對(duì)人類(lèi)健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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