姚媛媛 龍辰 王斌 李珣 李秀仙 張冬華 閆春財 劉文彬

摘要 為了解新煙堿類殺蟲劑對紅裸須搖蚊的毒性影響，以休眠期和發(fā)育期紅裸須搖蚊（Propsilocerus akamusi）幼蟲為材料，測試吡蟲啉（IMI）、噻蟲嗪（THI）、噻蟲胺（CLO）、呋蟲胺（DIN）、啶蟲脒（ACE）5種新煙堿類殺蟲劑對幼蟲的急性毒性差異，并探究亞致死濃度脅迫下發(fā)育期幼蟲體長和濕重的變化。結(jié)果表明，IMI、ACE和CLO毒性始終處于劇毒水平，且CLO毒性低于IMI和ACE;IMI對發(fā)育期幼蟲毒性略高于ACE，對休眠期則相反;DIN毒性始終為高毒水平;暴露于THI下，休眠期幼蟲耐受性顯著高于發(fā)育期幼蟲，并且在24～96 h的持續(xù)時間內(nèi)LC50出現(xiàn)30.90～95.49倍不等的耐受性差異。IMI脅迫組體長略有增長，其余組均表現(xiàn)為縮短，僅ACE組出現(xiàn)顯著變化;幼蟲濕重變化方面，IMI處理組幼蟲濕重增長顯著，均值在23.3 mg，其余組均保持在20.0 mg左右。

關(guān)鍵詞 紅裸須搖蚊;新煙堿類殺蟲劑;休眠期;發(fā)育期;急性毒性

中圖分類號 S482.3? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）20-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.001

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Acute Toxicity of Five Neonicotinoid Insecticides to the Larvae of Propsilocerus akamusi in Dormant and Developmental Phase

YAO Yuan-yuan1， LONG Chen2， WANG Bin3 et al

（1.Tianjin Natural History Museum， Tianjin 300201; 2.College of Life Sciences， Tianjin Key Laboratory of Conservation and Utilization of Animal Diversity， Tianjin Normal University， Tianjin 300387; 3.Tianjin Beidagang Wetland Nature Reserve Management Center， Tianjin 300270）

Abstract To understand the toxic effects of neonicotinoid insecticides on Propsilocerus akamusi， the larvae of Propsilocerus akamusi during the dormant and developmental phases were used as materials to test the acute toxicity difference of 5 neonicotinoid insecticides of imidacloprid （IMI）， thiamethoxam （THI）， clothianidin （CLO）， dinotefuran （DIN） and acetamiprid （ACE） to larvae，and explore the changes of body length and wet weight of larvae during developmental phase under sublethal concentration stress.The result showed that the toxicity of IMI， ACE and CLO was always at a severe level， and toxicity of CLO was lower than that of IMI and ACE.The toxicity of IMI higher than that of ACE in developmental phase， but lower in dormancy period;the toxicity of DIN was at a high level.In the case of THI，the tolerance of dormant larvae was significantly higher than that of developmental larvae， and the tolerance difference of LC50 varied from 30.90 to 95.49 times in 24-96 h.The body length of IMI stress group increased slightly， while that of the other groups decreased. Only ACE group showed significant changes. In terms of the change of larvae wet weight， the larvae wet weight of IMI treatment group increased significantly， with an average of 23.3 mg， and the rest groups maintained about 20.0 mg.

Key words Propsilocerus akamusi;Neonicotinoid insecticides;Dormant phase;Developmental phase;Acute toxicity

基金項目 國家自然科學基金項目（3167232 31801994）;天津市應用基礎計劃項目（18JCQNJC14700，18JCYBJC96100）。

作者簡介 姚媛媛（1987—），女，天津人，助理館員，碩士，從事動物系統(tǒng)學研究。*通信作者，講師，博士，從事動物系統(tǒng)學研究。

收稿日期 2021-02-03;修回日期 2021-03-29

搖蚊幼蟲對水質(zhì)變化敏感，常作為評估水體質(zhì)量的重要指示生物[1]。紅裸須搖蚊，隸屬于搖蚊科直突搖蚊亞科裸須搖蚊屬，為我國北方水體的優(yōu)勢種之一[2]。近年來，我國水污染情況嚴峻，尤其在紅裸須搖蚊廣泛分布的海河流域，自2011年起水質(zhì)監(jiān)測中為Ⅴ類水質(zhì)的比例在我國大型流域一直位于較高水平[3]。一系列研究發(fā)現(xiàn)污染物對水生生物產(chǎn)生較大毒害作用，為評估多種污染物對水生生物的毒性效應，許多學者以搖蚊幼蟲為材料開展了毒理學研究，如Arambourou等[4]研究發(fā)現(xiàn)暴露于重金屬污染的沉積物會使搖蚊幼蟲生長和繁殖活動受到顯著抑制;鄧萬蓉等[5]探究菲對搖蚊幼蟲的毒性效應，發(fā)現(xiàn)大于5 mg/kg的菲脅迫下可使搖蚊羽化時間顯著提前;Dos Santos Morais等[6]研究發(fā)現(xiàn)搖蚊暴露于亞慢性濃度鄰苯二甲酸芐基丁酯時，出現(xiàn)頭殼變窄、雄性成蟲翅長減小的現(xiàn)象，但這些研究多集中于重金屬和有機污染物，對殺蟲劑類污染物毒性研究較少。

新煙堿類殺蟲劑是目前生產(chǎn)中大量使用的一類殺蟲劑，具有無交互抗性、高效和低毒等特點，至2011年，全球年銷售額已近20億美元，占世界殺蟲劑1/5的市場份額。但由于該類殺蟲劑的大量和不合理使用，加之其高水溶性，造成了嚴重的環(huán)境污染問題，在多國水體和土壤中檢出多種新煙堿類殺蟲劑[7-9]。為評測該殺蟲劑大劑量使用及外排對非靶標生物的影響，相關(guān)毒性效應試驗已廣泛開展，許多研究發(fā)現(xiàn)，該殺蟲劑污染可通過花蜜殘留等方式對以蜜蜂為首的非靶標生物造成較大危害[10]，對家蠶、赤眼蜂等陸生昆蟲羽化及一系列生命活動產(chǎn)生極不利的影響[11-13]，此外，在致毒機理等方面也已取得較大的研究進展[14]，但這些研究一般為陸生非靶標昆蟲的成蟲階段，而對水生非靶標昆蟲幼蟲階段的研究則鮮有開展。

休眠和羽化為搖蚊生活史的重要階段，發(fā)育期幼蟲受環(huán)境因子影響積累達一定閾值可誘導羽化過程。Zou等[15]研究發(fā)現(xiàn)，紅裸須搖蚊幼蟲屬于狹溫性耐寒幼蟲，在4—10月時處于休眠狀態(tài)，11—12月時出現(xiàn)顯著發(fā)育現(xiàn)象，1月開始觀察到成蟲出現(xiàn)。休眠和羽化過程中，昆蟲體內(nèi)發(fā)生一系列復雜基因表達和代謝變化，對環(huán)境因子抗性也相應改變[16]，但紅裸須搖蚊對新煙堿類殺蟲劑是否存在基于休眠過程而表現(xiàn)的抗性差異目前尚不明確。

該研究以休眠期和發(fā)育期紅裸須搖蚊幼蟲為材料，選擇農(nóng)田使用量較廣的5種新煙堿類殺蟲劑開展急性毒性試驗，為評價水體新煙堿類殺蟲劑污染對搖蚊幼蟲危害、探究昆蟲休眠期抗性變化和搖蚊幼蟲用作新煙堿類殺蟲劑污染指示生物提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試生物

試驗用搖蚊幼蟲分別于紅裸須搖蚊發(fā)育期（2019年11月）和休眠期（2020年6月）購于紅蟲捕撈商，經(jīng)核實2批幼蟲在潮白河同一點位捕撈，根據(jù)Sther[17]的研究鑒定物種為紅裸須搖蚊（Propsilocerus akamusi），根據(jù)頭殼寬度判斷齡期，使用體視鏡挑選4齡幼蟲作為試驗材料。

1.2 馴化處理方法

將搖蚊幼蟲放置于實驗室內(nèi)長23.5 cm、寬13.5 cm、高14.5 cm的塑料容器中，使用光照除氯的自來水馴化培養(yǎng)7 d（水溫18～23 ℃、pH 8.2、溶解氧7.7～9.6 mg/L、總硬度7.1 mmol/L），容器存放于自然光照處，馴養(yǎng)期間用氣泵進行微曝氣，觀察到每日自然死亡幼蟲少于2%時，即挑選活性較強、體型大小均一的幼蟲進行毒性試驗。

1.3 供試試劑

70%吡蟲啉（IMI），浙江威爾達化工有限公司;

25%噻蟲嗪（THI），江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司;

30%噻蟲胺（CLO），北京華戎生物激素廠;

70%呋蟲胺（DIN），山東埃森化學有限公司;

70%啶蟲脒（ACE），山東中新科農(nóng)生物科技有限公司。

劑型均為水分散粒劑，配制所需濃度時，用除氯的自來水將顆粒溶解為一定濃度的母液，再稀釋至試驗所需濃度。

1.4 毒性試驗方法

試驗采用靜水染毒法，5種藥液試驗濃度設定具體見表1。設置僅添加除氯自來水的燒杯為空白對照，將試驗幼蟲放入盛有100 mL藥液的燒杯中，每個處理組添加20頭，設置3組重復，試驗過程中及時挑出死亡幼蟲，于處理24、48、72和96 h觀察染毒現(xiàn)象并統(tǒng)計死亡數(shù)，死亡標準為玻璃棒多次觸碰搖蚊幼蟲腹部后端未觀察到身體卷曲或擺動反應。

1.5 體長和濕重的測定

取發(fā)育期（2019年11月）幼蟲，使用96 h亞致死濃度（96 h-LC20）藥液脅迫搖蚊幼蟲，處理方法同“1.4”，暴露96 h后從每個處理組中隨機選取10頭搖蚊幼蟲，使用體視鏡和電子天平測定體長及濕重。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用概率單位法[18]，使用SPSS 19.0進行線性回歸分析，計算半致死濃度（LC50）及其95%置信區(qū)間，設置自變量為對數(shù)藥液濃度，因變量為幼蟲死亡概率單位，使用單因素ANOVA方差分析效應顯著性，P值小于0.05時視為影響顯著。將分析數(shù)據(jù)總結(jié)至Excel 2019制作表格，導入OriginPro 2017進行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性暴露下的中毒狀態(tài)

從5種新煙堿類殺蟲劑脅迫下的中毒狀態(tài)（表2）可以觀察到中毒行為隨處理濃度增大而顯著，具體表現(xiàn)為IMI、ACE、DIN脅迫下幼蟲均為頭尾向內(nèi)彎曲蜷縮，而THI和CLO則出現(xiàn)無規(guī)則擺動和身形扭曲。對于體色變化，除THI脅迫下幼蟲體色仍保持較紅外，其余4種殺蟲劑均出現(xiàn)體色變暗的現(xiàn)象，但程度不一，DIN脅迫下體色變?yōu)榘导t色，而IMI、CLO、ACE均為棕黑色。對死亡形態(tài)，與中毒行為存在一定程度上的對應，如出現(xiàn)向內(nèi)蜷縮行為的IMI、ACE、DIN脅迫組，最終死亡形態(tài)為“O”字型，而無規(guī)則擺動的THI最終死亡形態(tài)為棒直狀，對于CLO，則部分呈現(xiàn)一定程度的扭曲，另一部分為棒直狀。

2.2 亞致死濃度脅迫下幼蟲的體長和濕重變化

2.2.1 體長變化。

從圖1可以看出，亞致死濃度脅迫下，除IMI脅迫組體長略有增長，其余處理組均使搖蚊體長變短，但除ACE外，影響均不顯著。對箱體所示范圍，除IMI處理組使個體差異略有增大，其余各組均使組內(nèi)個體差異減小。

2.2.2 濕重變化。

從新煙堿類殺蟲劑處理下的濕重變化（圖2）可以看出，IMI處理組濕重增大顯著，均值在23.3 mg，其余處理組及對照組均保持在20.0 mg左右。IMI、THI和ACE處理組內(nèi)差異個體變大，而CLO和DIN處理組內(nèi)差異與對照組接近。

2.3 新煙堿類殺蟲劑對不同發(fā)育時期紅裸須搖蚊幼蟲的急性毒性差異

5種新煙堿類殺蟲劑對不同時期紅裸須搖蚊幼蟲的急性毒性如表3和表4所示，R2表明采用了線性回歸分析的毒力回歸方程擬合效果較好?？傮w上，5種新煙堿類殺蟲劑隨作用時間增長，對紅裸須搖蚊幼蟲的LC50均下降，以LC50為依據(jù)分析，對發(fā)育期幼蟲毒性由大到小依次為IMI、ACE、THI、CLO和DIN，而對休眠期幼蟲毒性由大到小依次為ACE、IMI、CLO、DIN和THI。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定外來污染物的急性毒性等級標準（表5）評價5種殺蟲劑急性毒性等級，結(jié)果顯示，對發(fā)育期幼蟲，除DIN為高毒外，其余殺蟲劑均為劇毒，而對休眠期幼蟲，DIN和THI均為高毒，其余為劇毒，表明水體新煙堿類殺蟲劑對紅裸須搖蚊幼蟲毒性較大，且對不同發(fā)育時期幼蟲毒性存在差異，具體表現(xiàn)為：對IMI和THI，在96 h內(nèi)休眠期幼蟲的耐受性均高于發(fā)育期;而對于CLO、DIN和ACE，在24 h內(nèi)休眠期幼蟲耐受性高，24h后則為發(fā)育期幼蟲耐受性較高。需要特別指出，對于THI脅迫，相較于發(fā)育期，休眠期幼蟲在24 h內(nèi)耐受性高出94.49倍，96 h時高出29.90倍，耐受性差異顯著;而對其他幾種殺蟲劑，耐受性差異均在0.72～1.51倍。此外，同一處理組在24～96 h下休眠期與發(fā)育期的LC50差異倍數(shù)在2.35～13.80倍，表明在半致死效應下，毒性的劑量對染毒時間的依賴程度存在較大差異。

3 結(jié)論與討論

該試驗以休眠期和發(fā)育期紅裸須搖蚊（Propsilocerus akamusi）4齡幼蟲為材料，探究5種新煙堿類殺蟲劑對不同發(fā)育時期幼蟲的急性毒性差異，結(jié)果顯示，在5種殺蟲劑中，吡蟲啉（IMI）、啶蟲脒（ACE）和噻蟲胺（CLO）毒性始終處于劇毒水平，且發(fā)育期IMI毒性略高于ACE，休眠期則相反，但CLO毒性始終低于IMI和ACE。呋蟲胺（DIN）毒性始終為高毒水平，且不同發(fā)育期毒性差異較小。而對于噻蟲嗪（THI），休眠期幼蟲耐受性顯著高于發(fā)育期幼蟲，在24～96 h的持續(xù)時間內(nèi)LC50出現(xiàn)30.90～95.49倍不等的差異。

吡蟲啉為目前農(nóng)田使用量最大的新煙堿類殺蟲劑，為科學制定該類殺蟲劑排放標準，該試驗使用4齡紅裸須搖蚊幼蟲對其進行急性毒性試驗，結(jié)果表明，吡蟲啉對4齡紅裸須搖蚊幼蟲的24 h-LC50、48 h-LC50、96 h-LC50分別為27.21、19.27、12.71 μg/L。該結(jié)果與其他種搖蚊幼蟲相比，抗性差異不大，如Njattuvetty Chandran等[19]用吡蟲啉對1齡溪流搖蚊（Chironomus riparius）幼蟲脅迫得出24 h-LC50為31.5 μg/L，Azevedo-Pereira等[20]用2齡溪流搖蚊幼蟲試驗得出48 h-LC50為19.9 μg/L，Pestana等[21]用2齡溪流搖蚊幼蟲試驗得出96 h-LC50為12.94 μg/L。比較發(fā)現(xiàn)，紅裸須搖蚊在吡蟲啉抗性上與溪流搖蚊無顯著差異。另有研究對3齡的伸展搖蚊幼蟲（Chironomus tentans）進行吡蟲啉暴露，算得96 h-LC50為5.75 μg/L[22]。而近年來，稀疏搖蚊（Chironomus dilutus）幼蟲也逐漸進入國內(nèi)外毒理學學者視野，一系列試驗結(jié)果顯示吡蟲啉對2齡幼蟲96 h-LC50為4.63 μg/L[23]、3齡幼蟲96 h-LC50為2.65 μg/L[24]和11.8 μg/L[25]，試驗結(jié)果存在一定差異，其原因在于不同學者使用的毒性暴露方式和前處理條件不同，但總體上紅裸須搖蚊對吡蟲啉抗性略高于稀疏搖蚊。

而吡蟲啉對其他水生生物的急性毒性試驗已有大量學者完成，如大型溞[26]、斑馬魚[27-29]、澤蛙蝌蚪[30]、鯉魚[31]、日本沼蝦[31]、克氏原螯蝦[32]等，總結(jié)如下：大型溞48 h-LC50為5.02 mg/L;斑馬魚96 h-LC50為281.37 mg/L;澤蛙蝌蚪24、48、72、96 h的LC50分別為365.9、307.7、257.1和217.9 mg/L;鯉魚24、48、72、96 h的LC50分別為208.3、138.8、108.9和96.4 mg/L;日本沼蝦24和48 h的LC50分別為88.5和34.8 μg/L;克氏原螯蝦96 h-LC50為10.98 mg/L。總體上看，耐受性斑馬魚>澤蛙蝌蚪>鯉魚>克氏原螯蝦>大型溞>日本沼蝦>搖蚊幼蟲，其中，吡蟲啉對搖蚊幼蟲和日本沼蝦達到劇毒評級，大型溞接近中毒，而克氏原螯蝦、斑馬魚、澤蛙蝌蚪和鯉魚均為微毒。

對其余幾種新煙堿類殺蟲劑，有學者研究稀疏搖蚊（Chironomus dilutus）2齡幼蟲對噻蟲胺和噻蟲嗪的96 h-LC50分別為5.93和55.34 μg/L[23]。Raby等[25]研究了多種新煙堿類對3齡稀疏搖蚊幼蟲的96 h-LC50分別為啶蟲脒2.8 μg/L、噻蟲胺11.6 μg/L、呋蟲胺23.5 μg/L、吡蟲啉11.8 μg/L、噻蟲嗪61.9 μg/L。與該試驗結(jié)果相比，紅裸須搖蚊對呋蟲胺抗性高，但對噻蟲嗪抗性較低。

盡管近10年多種新煙堿類殺蟲劑的污染受到毒理學學者持續(xù)關(guān)注，但對除吡蟲啉以外的新煙堿類殺蟲劑研究仍較少，近年來我國噻蟲嗪僅有對中華蟾蜍蝌蚪[33]、斑馬魚[27]等研究;啶蟲脒僅有對大型溞[26]、斑馬魚[29]、虎紋蛙蝌蚪[34]、中華蟾蜍蝌蚪[35]等研究;呋蟲胺僅有對斑馬魚[36]等研究;噻蟲胺僅有對大型溞[27]等研究。在殺蟲劑市場多元化的大趨勢下，多種污染物并存的情況愈發(fā)常見，在這個沉重的背景下，為科學衡量污染物含量與毒性關(guān)系，合理制定相關(guān)排放標準，毒理學的研究已刻不容緩。

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