孟永康，雷祝兵，梅 茜，董文飛

（1.長春理工大學(xué) 機電工程學(xué)院，吉林 長春 130022；2.中國科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163；3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院（蘇州）生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，安徽 合肥 230026）

1 引言

隨著微流控技術(shù)的快速發(fā)展，微流控芯片可在幾平方厘米甚至更小尺度上完成傳統(tǒng)實驗室的樣品制備、分離、純化、檢測等過程[1]，具有體積小、集成度高、分析速度快、消耗試劑少等優(yōu)點[2]，被廣泛運用于生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、分析化學(xué)等領(lǐng)域。其中碟式微流控芯片以離心力為液體流動的驅(qū)動力[3-4]，結(jié)合被動閥如毛細閥、虹吸閥[5-6]和主動閥如蠟閥[7]，只需要一個小型的電機就能同時對多個獨立單元結(jié)構(gòu)進行控制，實現(xiàn)對芯片內(nèi)液體的精準(zhǔn)控制[8]。此外，碟式芯片的多重分析單元可以同時檢測多份樣本，易于實現(xiàn)較高通量的檢測[9]。目前，碟式微流控芯片已經(jīng)廣泛應(yīng)用于血清分離、DNA提取、蛋白質(zhì)和核酸分析等領(lǐng)域[10-11]。

尿液是易獲得的體液來源，屬于無創(chuàng)檢測，傳統(tǒng)的腎功能指標(biāo)，如血尿肌酐水平檢測[12]已經(jīng)無法滿足早期診斷的需要。尿液中蛋白質(zhì)的含量高低是臨床中對相關(guān)疾病進行診斷的一項重要指標(biāo)[13]。例如視黃醇結(jié)合蛋白（RBP）主要在肝臟合成，分泌到血液的一種低分子量蛋白，分子量約為22 kD，可迅速被腎小球濾過，且絕大部分被近端腎小管上皮細胞重吸收，極少量從尿液排除。當(dāng)腎臟濾過功能降低時，尿液中RBP含量顯著升高。尿RBP排量與腎小管間質(zhì)損害程度有明顯相關(guān)性，可作為腎病監(jiān)測、指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后的指標(biāo)[14-15]。大型、全自動生化分析系統(tǒng)在臨床應(yīng)用比較廣泛，但目前針對尿液的蛋白質(zhì)快速檢測系統(tǒng)開發(fā)程度不足，檢測特異性不高。

本文結(jié)合微流控技術(shù)與生化分析技術(shù)，設(shè)計了一款基于離心力驅(qū)動的碟式微流控芯片，實現(xiàn)微量樣品轉(zhuǎn)移、與試劑混合及檢測等功能，使用COMSOL對芯片的毛細閥和虹吸閥結(jié)構(gòu)進行仿真分析，驗證結(jié)構(gòu)的合理性，優(yōu)化轉(zhuǎn)速，采用高精度數(shù)控雕刻機制備芯片。圍繞微流控芯片，研制了一套小型化、全自動尿液生化檢測系統(tǒng)，并在該系統(tǒng)上進行了尿視黃醇結(jié)合蛋白檢測分析，探討了微流控芯片用于尿液蛋白自動化檢測的可行性。

2 材料和方法

2.1 碟式微流控芯片設(shè)計和制作

微流控芯片制作所需的主要材料包括PMMA硬質(zhì)塑料板材，PMMA薄膜，PMMA壓敏膠，加工設(shè)備為數(shù)控雕刻機（北京精雕集團JDPMS6_A）。使用3D CAD軟件（Solidworks 2016）繪制微流控芯片結(jié)構(gòu)，如圖1所示，芯片上含有4個相同的結(jié)構(gòu)單元，每個單元由樣品腔、試劑腔R1和R2、混合室、檢測室、閥以及各腔室的通氣孔組成。樣品腔和檢測室深度分別為0.5 mm和2 mm，試劑腔R1、R2和混合室深度為1.5 mm，虹吸閥和毛細閥的寬度和深度均為0.3 mm，而鐵蠟閥的寬度和深度分別為1.1 mm和0.45 mm，詳細尺寸如圖2所示。將PMMA板材固定在機床臺面上，根據(jù)寬度選擇對應(yīng)尺寸的刀具，腔室和鐵蠟閥結(jié)構(gòu)使用直徑分別為1 mm和0.3 mm的單刃刀具，虹吸閥和毛細閥使用直徑為0.2 mm的單刃刀具。將結(jié)構(gòu)圖轉(zhuǎn)成數(shù)控代碼導(dǎo)入數(shù)控雕刻機控制軟件，通過雕刻機在PMMA板材加工出與繪制結(jié)構(gòu)一致的微流道和腔室，如圖3所示。芯片上多個單元既可以實現(xiàn)單人份不同物質(zhì)的分析檢測，也可以實現(xiàn)多人份同一物質(zhì)的檢測和多人份不同物質(zhì)的檢測。

圖1 碟式微流控芯片示意圖（a）和截面圖（b）Fig.1 (a) Schematic diagram and (b) section view of a disc microfluidic chip

圖2 微流控芯片單元結(jié)構(gòu)和尺寸Fig.2 Unit structure and dimensions of a disc microfluidic chip

圖3 芯片實物圖Fig.3 Photograph of a disc microfluidic chip

為清除加工過程中在腔室和流道內(nèi)及周邊由飛屑導(dǎo)致的殘留物，將芯片用含有Micro-90的去離子水超聲清洗10 min，然后經(jīng)過去離子水超聲清洗 10 min，取出后用氮氣吹干其表面，置于70℃烘箱烘干30 min。

2.2 鐵蠟閥的設(shè)計和制備

采用數(shù)控精雕機在鋁板上制作相同尺寸的鐵蠟塊模具，如圖4(a)所示，模具孔洞尺寸為 1.1 mm×1 mm×0.5 mm。鐵蠟溶液由融化的石蠟和鐵磁液（Ferrotec MPG2100）[16]按體積比100∶1混合并攪拌均勻，將鐵蠟溶液注入70℃鐵蠟?zāi)＞呖锥春笞匀焕鋮s，脫模后取下鐵蠟塊（圖4（b））備用。將鐵蠟塊填充到鐵蠟閥腔室后，用PMMA壓敏膠完成芯片粘合。鐵蠟閥腔室的尺寸設(shè)計為1.1 mm×1.1 mm×0.45 mm，有利于鐵蠟塊填充，但鐵蠟塊與其腔室之間存在一定間隙，因此，將封裝后的芯片在70℃的烘箱中放置2 min，此時，輕微融化的鐵蠟將注滿鐵蠟閥腔室，從而確保鐵蠟閥門呈關(guān)閉狀態(tài)。需要開啟時，使用456 nm、3 W激光二極管照射鐵蠟塊，鐵磁液中納米氧化鐵顆粒吸收激光能量后升溫至石蠟融化，流向兩個輔助腔室的圓形區(qū)域，閥門開啟的響應(yīng)時間快至5 s，如圖4（c）所示。

圖4 鐵蠟閥的制造和應(yīng)用Fig.4 The fabrication and application of ferrowax valves

2.3 碟式微流控芯片被動閥結(jié)構(gòu)仿真

碟式微流控芯片中的液體在離心力的作用下突破毛細閥進入下一個腔室的過程為不可壓縮流體的液-氣兩相流，基本控制方程包括連續(xù)性方程、動量方程和計算相界面的水平集方程。

連續(xù)性方程為：

其中，u為流體速度，單位為m/s。

納維-斯托克斯方程為：

其中，ρ為流體密度，單位為kg/m3；t為時間，單位為s；μ為流體動力黏度，單位為Pa·s；P為流體壓力，單位為Pa；F為作用在流體上的體積力，單位為N/m3。

水平集方程為：

其中，

Φ為水平集函數(shù)，本文取為1；γ為初始化參數(shù)，單位為m/s；ε為界面厚度控制參數(shù)，單位為m；ρ1和ρ2分別為連續(xù)相、離散相的密度，單位為kg/m3；μ1和μ2分別為連續(xù)相和離散相的動力黏度，單位為Pa·s。

采用COMSOL Multiphysics軟件對試劑腔R1（水，深紅色）和混合室1（空氣，藍色）建立流體力學(xué)模型進行仿真[17]。室溫25℃時，水和空氣的密度分別為977 kg/m3和1.614 kg/m3，動力黏度分別為8.55×10?4Pa·s和1.864×10?5Pa·s，水-空氣表面張力為7.2×10?2N/m。對物理場各參數(shù)進行初始設(shè)置，由于液體較少，可以忽略重力對液體的影響。入口為R1腔室的進樣口，設(shè)置速度為零；出口為混合室底部，液體突破毛細閥進入混合室與靜壓力無關(guān)，所以設(shè)定出口壓力為零。指定無滑移壁面邊界條件（即速度為零），除入口和出口外的所有邊界為濕壁。以芯片圓心為旋轉(zhuǎn)中心，試劑腔R1距離圓心9 mm，試劑腔R1為水相，擴散 系 數(shù) 為1×10?9m2/s，其 余 壁 面 的 接 觸 角為72°（芯片材料為PMMA），通過旋轉(zhuǎn)芯片產(chǎn)生離心力和科里奧利力控制流體流動，而這些力可通過改變角速度來調(diào)節(jié)，使用水平集的方法計算液面變化。通過仿真計算顯示角速度達到60 rad/s（約為9.55 r/s）時，液體突破毛細閥進入混合室。圖5（彩圖見期刊電子版）仿真結(jié)果用流體（水）的體積分數(shù)來表達，即采用體積分數(shù)表示流體（水）在芯片中的流動，通過不同相函數(shù)Φ的變化，追蹤不同相邊界的變化。如圖5所示，標(biāo)尺液體首先在與混合室的連接處形成一個圓弧型的彎月面，在離心力作用下，液體陸續(xù)進入混合室。

圖5 液體突破毛細閥仿真圖Fig.5 Simulation results of liquid breaking through the capillary valve

采用同樣方法對樣品室（水）和虹吸閥（空氣）建立流體力學(xué)模型，并進行模擬仿真。初始界面為樣品室和虹吸閥的連接面，當(dāng)角速度為60 rad/s時，液體不能突破虹吸閥；角速度降低為6 rad/s(約0.95 r/s)時，樣品室液體在1 s時即可突破虹吸閥頂部，仿真結(jié)果如圖6所示。在高速旋轉(zhuǎn)時，離心力將液體保持在虹吸管道頂端下方，液體不能轉(zhuǎn)移到混合室，當(dāng)轉(zhuǎn)速降到低于臨界值，毛細力引發(fā)虹吸作用，液面超過虹吸管道頂部開始流動。

圖6 不同轉(zhuǎn)速的虹吸閥仿真結(jié)果Fig.6 Simulation results of siphon valve at various spin speeds

2.4 模擬實驗過程

為了驗證芯片內(nèi)液體的流動情況，采用混入紅、綠色素的純水代替樣品和試劑進行實驗，通過高幀頻相機記錄液體在芯片內(nèi)轉(zhuǎn)移的過程，如圖7（彩圖見期刊電子版）所示。

圖7 樣品和試劑的轉(zhuǎn)移和混勻Fig.7 The transport and mixing of the sample (light pink)and reagent (green and red)

將淡粉色水、綠色水和紅色水分別加入樣品室、試劑腔R1和試劑腔R2，在轉(zhuǎn)速為10 r/s時，R1腔室中綠色液體先進入混合室1，降低轉(zhuǎn)速到1 r/s，樣品室中的淡粉色液體填充虹吸閥，再次提高轉(zhuǎn)速至 20 r/s，紅色液體從樣品室和虹吸閥中轉(zhuǎn)移到混合室1中。在轉(zhuǎn)速為5 r/s時正轉(zhuǎn)45°，反轉(zhuǎn)45°，持續(xù)10 s使液體混合，混合結(jié)束后，降低轉(zhuǎn)速至0.9 r/s，使混合室中的液體填充虹吸閥，提高轉(zhuǎn)速至10 r/s，轉(zhuǎn)移液體到檢測室。采用465 nm激光照射使鐵蠟閥中鐵蠟溶解，并打開閥門，接著提高轉(zhuǎn)速至10 r/s，將紅色液體從R2腔室轉(zhuǎn)移到檢測室，調(diào)節(jié)電機轉(zhuǎn)速為5 r/s，正反轉(zhuǎn)45°持續(xù)10 s對試劑進行混合。

3 檢測原理和雙光路補償

3.1 光學(xué)檢測原理

微流控生化分析系統(tǒng)的檢測原理是基于光電比色法和郎伯比爾定律（Lamber-Beer law），其表達式為[18]

其中，A為吸光度；I0為入射光強；I為透射光強；k為吸光系數(shù)，單位為L/g·cm；b為光程，單位為cm；c為被測物的質(zhì)量濃度，單位為g/L。

3.2 檢測系統(tǒng)控制結(jié)構(gòu)

檢測系統(tǒng)由上位機、單片機、旋轉(zhuǎn)電機、LED光源和信號采集系統(tǒng)等組成，如圖8所示，上位機通過串口通信向單片機發(fā)送控制指令，調(diào)節(jié)電機的速度參數(shù)（加速度和終速度）、啟動及停止電機，實現(xiàn)對芯片的轉(zhuǎn)動控制。樣品和試劑在離心力及毛細力作用下轉(zhuǎn)移、混勻，最后在檢測室發(fā)生反應(yīng)并進行吸光度檢測。檢測時LED光源非持續(xù)性發(fā)光，采用旋轉(zhuǎn)檢測方式，芯片上4個單元逆時針依次經(jīng)過檢測位置，單片機控制光源開啟，光源通過光纖傳輸?shù)叫酒瑱z測室上方，透射過芯片的光源再次通過光纖傳輸?shù)焦怆姸O管，經(jīng)信號放大模塊放大后，通過USB-4704數(shù)據(jù)采集卡（研華科技）轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號，采樣頻率為20 Hz，最后傳輸?shù)缴衔粰C并進行存儲。

圖8 系統(tǒng)控制流程圖Fig.8 Flow chart of the system control

3.3 光源波動的雙光路補償

檢測系統(tǒng)采用測量光和參考光雙光路補償設(shè)計，可消除光源自身波動引起的誤差，其實物圖如圖9（a）所示。微流控芯片的光學(xué)檢測裝置包括光源、聚光透鏡、濾光片、二向色鏡、非偏振分束立方體、帶準(zhǔn)直透鏡的光纖、光電二極管等，如圖9（b）（彩圖見期刊電子版）所示，紅色箭頭代表700 nm光源光路，綠色箭頭代表546 nm光源光路。光源經(jīng)過濾光片和聚光透鏡后，通過非偏振分束立方體中的10∶90分束鏡，即一束10%的光直接進入?yún)⒖脊饴返墓怆姸O管；另一束90%的光經(jīng)過聚光透鏡和光纖接頭，再從光纖末端的自聚焦準(zhǔn)直透鏡進入芯片檢測腔室，透射出的光再次通過光纖傳送到光電二極管轉(zhuǎn)化為電信號。

圖9 光學(xué)檢測系統(tǒng)Fig.9 Optical detection system

光源發(fā)出的光強設(shè)置為I0，非偏振分束立方體的分光比為RR/RS，測量光路受到光纖的影響為αS，兩個光路使用相同的放大模塊對光電二極管產(chǎn)生的信號進行處理，假定測量通道放大模塊對光強的影響為βS，參考通道放大模塊對光強的影響為βR。

下位機測量通道采集的電壓信號為

參考通道采集的電壓信號為

由于使用的放大模塊相同，所以βS和βR的值相等，將式（7）和式（8）相除得

在測量通道的光纖沒有受到外界影響的情況下，光纖對測量通道的影響保持不變，所以αS為固定值，非偏振分束立方體的分光比為固定值，因此M為常數(shù)。

對光源變化導(dǎo)致的參考光路和檢測光路電壓改變進行測量，通過對測量數(shù)據(jù)進行線性擬合，用于檢測系統(tǒng)的補償修正。對波長為546 nm和700 nm的光源分別進行3次測量，并通過Matlab對兩個光路采集的數(shù)據(jù)進行擬合，以參考通道數(shù)據(jù)為x軸，測量通道數(shù)據(jù)為y軸，兩個通道在不同波長的光源下擬合關(guān)系如圖10所示。結(jié)果表明兩個通道都具有較好的線性相關(guān)性（即擬合優(yōu)度R2接近1），且具有較好的重復(fù)性。546 nm波長下，兩光路的線性關(guān)系近似為y=3.3x+0.08；700 nm波長時，兩光路的線性關(guān)系近似為y=2.54x+0.08。擬合得到的線性關(guān)系系數(shù)將用于后續(xù)生化檢測實驗的兩個光路補償修正。

圖10 雙光路線性關(guān)系Fig.10 The linear relationship between two optical paths

4 實驗和結(jié)果

4.1 試劑和方法

尿視黃醇結(jié)合蛋白（Urinary Retinol Binding Protein, URBP）檢測試劑盒，包括URBP低濃度（1 mg/L）和高濃度（4.3 mg/L）質(zhì)控品、URBP校準(zhǔn)品（9.3 mg/L）、緩沖液（R1）和包被抗體的乳膠微球（R2），購自寧波美康生物科技股份有限公司。

檢測原理為乳膠增強免疫比濁法，其主/副波長為546 nm/700 nm，分析方法為兩點終點法。

檢測步驟如下：將5 μL樣品，120 μL R1和30 μL R2分別加入芯片的樣品室，試劑腔R1和試劑腔R2，將芯片放入檢測系統(tǒng)，啟動控制程序。簡言之，R1和樣品先后進入混合室，混勻后孵育5 min，然后轉(zhuǎn)移到檢測室。在鐵蠟閥開啟后，R2進入檢測室混勻，孵育10 s后，讀取546 nm和700 nm的吸光度值，計算第一點吸光度值，即A1=A546?A700；孵育5 min后再次讀取546 nm和700 nm的吸光度值，計算第二點吸光度，；計算兩點吸光度差值，即ΔA=A2?A1。

4.2 芯片檢測URBP精密度

根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）EP05-A3指南對精密度的驗證方法，分別測試高低兩個臨床診斷水平的URBP濃度（1 mg/L和4.3 mg/L），上述兩個濃度的質(zhì)控品均來自寧波美康生物科技股份有限公司，已獲得醫(yī)療器械注冊證（浙械標(biāo)準(zhǔn)20142400062），將高低濃度的質(zhì)控品在芯片上各重復(fù)測試10次，分別計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)(CV)。表1為低濃度質(zhì)控品（1 mg/L）重復(fù)測量的兩點吸光度差值，經(jīng)計算ΔA的平均值為0.00999，標(biāo)準(zhǔn)差為0.00024，CV為2.42%；表2為高濃度質(zhì)控品（4.3 mg/L）重復(fù)測量的兩點吸光度差值，計算ΔA的平均值為0.03853，標(biāo)準(zhǔn)差為0.0005，CV為1.30%。高濃度和低濃度質(zhì)控品精密度都滿足CV≤5%，說明系統(tǒng)具有較好的重復(fù)性。

表1 芯片檢測1 mg/L URBP質(zhì)控品的吸光度差值Tab.1 Absorbance difference of 1 mg/L URBP quality control product measured by the microfluidic chip

表2 芯片檢測4.3 mg/L URBP質(zhì)控品的吸光度差值Tab.2 Absorbance difference of 4.3 mg/L URBP quality control product measured by the microfluidic chip

4.3 校準(zhǔn)曲線

將濃度為9.3 mg/L URBP校準(zhǔn)品用生理鹽水按稀釋因子1、1/2、1/4、1/8、1/16和0稀釋為6個濃度梯度9.3 mg/L、4.65 mg/L、2.32 mg/L、1.16 mg/L、0.58 mg/L和0，每個濃度重復(fù)測定3次。以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，各濃度校準(zhǔn)品對應(yīng)的吸光度差值的平均值為縱坐標(biāo)，進行l(wèi)ogit曲線擬合，得到曲線如圖11所示。

圖11 校準(zhǔn)曲線Fig.11 Calibration curve

線性擬合得到的濃度和吸光度差值的線性關(guān)系為y=A2+(A1?A2)/[1+(x/x0)p]，其中A1=0.00314，A2=0.05668，x0=3.28686，p=1.60767，擬合系數(shù)R2=0.99549，結(jié)果表明濃度和吸光度值有良好的相關(guān)性。

5 結(jié)論

本文構(gòu)建了一款基于離心力的集成碟式微流控芯片，闡述了芯片的結(jié)構(gòu)和制造工藝，并研制了全自動尿液蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)，通過雙光路設(shè)計和雙波長檢測方法降低光源波動和背景干擾對檢測結(jié)果的影響。整個過程只需加樣、離心、孵育和光電檢測等過程全部在芯片上完成，10 min左右可完成4個樣本的測試，設(shè)備具有便攜、操作簡單、樣品用量少、檢測效率高等優(yōu)點，可廣泛用于各類現(xiàn)場檢測。

采用尿RBP質(zhì)控品和校準(zhǔn)品作為實驗樣本，分別驗證了系統(tǒng)的精確度和校準(zhǔn)曲線。實驗結(jié)果顯示，兩個濃度質(zhì)控品精密度的變異系數(shù)在1.3%～2.46%，說明系統(tǒng)具有較好的重復(fù)性。尿RBP校準(zhǔn)品的濃度梯度實驗表明濃度和吸光度值有良好的線性相關(guān)性（R2=0.995）。上述結(jié)果證明了芯片及尿液蛋白檢測系統(tǒng)的可行性以及實用性，該芯片的臨床有效應(yīng)用還需要大量實驗的進一步驗證，但本系統(tǒng)為后續(xù)基于離心力的微流控芯片的化學(xué)發(fā)光免疫分析、核酸檢測等奠定了研究基礎(chǔ)。