闕曉慧， 桂蜀華， 鐘清元， 于兵兵， 林 好

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

生地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥根，熟地黃為生地炮制而來。古籍記載熟地以“色黑如漆”的九蒸九曬熟地(下文稱九曬熟地)入藥為佳[1]，現(xiàn)今熟地多采用一次性炮制，包括一次性蒸烘炮制(下文稱一烘熟地)和一次性蒸曬炮制(下文稱一曬熟地)。中醫(yī)認(rèn)為腎主生殖，卵子為生殖之精，熟地傳統(tǒng)功效為補(bǔ)腎填精[2]，課題組前期證明九曬熟地與一烘熟地對(duì)卵巢排卵的影響不同，提示地黃未炮制透則會(huì)影響卵巢排卵[3]。

生地性寒，熟地性溫，將生地炮制為熟地的目的是為了制約生地的寒性，不同炮制程度的地黃作用物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生改變[4]，其寒熱藥性不同，從而可能使其對(duì)卵巢的作用不同。為了進(jìn)一步探究地黃的寒熱藥性對(duì)卵巢的影響，本研究將進(jìn)一步比較生地、一曬熟地與九曬熟地三種不同炮制程度的地黃對(duì)小鼠卵巢卵泡的影響，并分析可能與寒熱藥性相關(guān)的化學(xué)成分，豐富地黃的藥性理論研究，并為地黃的科學(xué)炮制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)KM雌性小鼠30只，性成熟，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)20180034，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(粵)2018-0085，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，維持12 h/12 h明暗交替照明，自由進(jìn)食飲水。

1.2 試劑與藥物 生地黃購(gòu)于河南省焦作市武陟縣地黃種植戶，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室吳文如副教授鑒定為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥塊根。蘇木素-伊紅染色液(北京里根生物技術(shù)有限公司)；PBS粉末(武漢博士德生物工程有限公司)；免疫組化筆(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷(純度>98%，北京索萊寶科技有限公司)；FSHR抗體(杭州華安生物技術(shù)有限公司)。甲醇、甲酸(色譜純，德國(guó)默克公司)；甲醇(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；福爾馬林(廣州永津生物科技有限公司)。

1.3 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-20A色譜工作站(日本島津公司)；STP120梯度脫水機(jī)、Histosta石蠟包埋機(jī)、HM340E半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)、Gemini AS自動(dòng)染色機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；BX53生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；EL204電子分析天平(十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；0.22 μm微孔濾膜(天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 熟地黃制備 取個(gè)頭相近的生地若干，洗凈表面泥沙，以0.2 mL/g水潤(rùn)制4 h，蒸制12 h，曬制7 h，為一次蒸制，所記為一曬熟地半成品，重復(fù)上述步驟8次，得九蒸九曬熟地半成品，切成2～3 mm厚片，置于50 ℃烘箱中干燥7 h，即得，拍照后避光保存于干燥罐中。

2.2 不同炮制程度地黃對(duì)小鼠卵巢的影響

2.2.1 藥液制備 取生地或熟地20.0 g，加100 mL蒸餾水煎煮1 h，濾過，濾渣加50 mL蒸餾水煎煮0.5 h，濾過，合并濾液，濃縮至50 mL，制成質(zhì)量濃度為0.4 g/mL的水提液。取媽富隆片1片(0.081 g)，加90 mL蒸餾水溶解，制成質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL的溶液。

2.2.2 分組與給藥 30只小鼠隨機(jī)分為空白組、生地組、一曬熟地組、九曬熟地組、媽富隆組，每組6只，灌胃給予4.5 g/kg蒸餾水、不同炮制程度地黃、12.2 g/kg媽富隆，每天1次，共30 d。

2.2.3 動(dòng)情周期觀察 給藥期間，每日早晨8點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行陰道涂片檢查[5]，顯微鏡觀察脫落細(xì)胞形態(tài)，判斷小鼠所處動(dòng)情周期階段。

2.2.4 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 處死小鼠，分離左側(cè)卵巢，置于福爾馬林溶液中固定48 h，經(jīng)脫水、包埋、切制5 μm石蠟切片(連續(xù)切片)后進(jìn)行常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察每個(gè)卵巢樣本第5片切片的卵泡形態(tài)，對(duì)竇前卵泡、竇狀卵泡進(jìn)行計(jì)數(shù)，拍照。

2.2.5 卵巢組織促卵泡生成素受體(FSHR)表達(dá)檢測(cè) 小鼠左側(cè)卵巢組織石蠟切片經(jīng)脫蠟后，按照相關(guān)說明書采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)FSHR表達(dá)。

2.3 寒熱藥性相關(guān)成分分析

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱定對(duì)照品5-羥甲基糠醛2 mg、毛蕊花糖苷0.5 mg，40%甲醇定容于2 mL量瓶中，各移取1 mL于5 mL量瓶中，40%甲醇稀釋并定容至刻度，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 取生地、熟地飲片剪碎，精密稱取1.000 g至平底燒瓶中，加入40%甲醇20.00 mL冷浸24 h，濾過，收集濾液，移取10.00 mL至10 mL量瓶中，即得。

2.3.3 地黃HPLC指紋圖譜建立 色譜條件為Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(含0.02%甲酸)(B)，梯度洗脫(0～10 min，0%～0.1%A；10～20 min，0.1%～0.5%A；20～25 min，0.5%～1%A；25～30 min，1%～2%A；30～40 min，2%～7%A；40～60 min，7%～15%A；60～70 min，15%～21%A；70～80 min，21%～30%A)；體積流量1 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.4 多元統(tǒng)計(jì)分析 將不同炮制程度地黃HPLC指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1.0多元統(tǒng)計(jì)分析軟件，進(jìn)行偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，分析VIP得分>1的成分，比較其在不同炮制程度地黃中的變化。

3 結(jié)果

3.1 不同炮制程度地黃對(duì)小鼠動(dòng)情周期的影響 陰道涂片結(jié)果見圖1A。如圖1B所示，給藥前各組小鼠動(dòng)情周期無明顯變化(P>0.05)。如圖1C所示，給藥后與空白組比較，九曬熟地對(duì)小鼠動(dòng)情周期無明顯變化(P>0.05)，而生地、媽富隆有所延長(zhǎng)(P<0.01)；與九曬組比較，生地、媽富隆可延長(zhǎng)小鼠動(dòng)情周期(P<0.01)。

3.2 不同炮制程度地黃對(duì)卵泡形態(tài)及數(shù)量的影響 卵巢HE染色結(jié)果(×200)見圖2A。如圖2B所示，各組閉鎖卵泡與空白組比較無明顯變化(P>0.05)；而九曬組閉鎖卵泡較生地組、媽富隆組減少(P<0.01)。如圖2C所示，九曬組竇前卵泡較空白組增加(P<0.05)。如圖2D所示，九曬組較生地組和空白組竇狀卵泡增加(P<0.05，P<0.01)。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與九曬熟地組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 不同炮制程度地黃對(duì)卵巢組織FSHR表達(dá)的影響 如圖3所示，九曬組FSHR表達(dá)較生地組、一曬熟地組、媽富隆組增加(P<0.01)；九曬熟地組、一曬熟地組、媽富隆組FSHR表達(dá)較空白組增加(P<0.01)。

3.4 寒熱藥性相關(guān)成分分析 3種炮制程度地黃在205、284 nm波長(zhǎng)處，共標(biāo)定9個(gè)共有峰，見圖4。在用于分析九曬熟地與生地之間成分差異的OPLS-DA模型中，R2X=0.990，R2Y=0.996，Q2=0.993；在用于分析九曬熟地與一曬熟地之間成分差異的OPLS-DA模型中，R2X=0.845，R2Y=0.981，Q2=0.973。九曬熟地聚為一類，生地聚為一類(圖5A)；1～4號(hào)峰的VIP得分>1(圖5B)；一曬熟地聚為一類，九曬熟地聚為一類(圖5C)；1～4、6號(hào)峰VIP得分>1(圖5D)。另外，1～4號(hào)峰峰面積隨炮制程度加深增加，6號(hào)峰隨炮制程度加深峰面積減少，見圖6。

注：A～B中RRR為生地，SDPRR1為一曬熟地，SDPRR9為九曬熟地；C、D分別為284 nm、205 nm下對(duì)照品；E為40%甲醇的HPLC譜圖。

圖5 多元統(tǒng)計(jì)分析

圖6 地黃HPLC共有峰峰面積變化

4 討論

卵巢是女性主要的生殖器官，為水火之臟，卵子的順利發(fā)育、排出與腎中陰陽的順利轉(zhuǎn)化有關(guān)[6-7]。動(dòng)情周期是雌性哺乳動(dòng)物性成熟后，生殖器官發(fā)生增生退化的周期性變化，動(dòng)情周期延長(zhǎng)或停滯提示排卵受影響[8]，本研究中，生地延長(zhǎng)小鼠動(dòng)情周期，而一曬熟地、九曬熟地對(duì)小鼠動(dòng)情周期無影響，說明熟地性溫，入腎經(jīng)能夠順應(yīng)腎中陰陽轉(zhuǎn)化，使卵子順利排出，而生地性寒，入腎經(jīng)不利腎中陰陽轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致排卵推遲。

卵巢中卵泡在排卵前的發(fā)育需經(jīng)歷竇前卵泡、竇狀卵泡等的一系列過程，F(xiàn)SHR在卵泡的發(fā)育過程中有重要作用，F(xiàn)SHR與其配體促卵泡生成素(FSH)結(jié)合，可以激活多種酶促反應(yīng)，促進(jìn)卵巢中性激素的合成，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育[9]。高表達(dá)FSHR的卵泡，在卵泡募集、選擇的階段，即使在FSH水平低的情況下，亦能利用低水平FSH，促進(jìn)卵泡的發(fā)育，而低表達(dá)FSHR的卵泡則不能順利發(fā)育，最終趨于閉鎖[10]。本實(shí)驗(yàn)中，九曬熟地較空白組增加小鼠卵巢竇前卵泡、竇狀卵泡的數(shù)量，而生地、一曬熟地與空白組比較對(duì)竇前卵泡、竇狀卵泡無影響，且九曬熟地較生地組竇狀卵泡數(shù)量增加，可能是由于九曬熟地性溫，補(bǔ)腎填精而夠促進(jìn)卵泡發(fā)育，而生地性寒，一曬熟地的溫?zé)崴幮圆患熬艜袷斓?，故未表現(xiàn)出促進(jìn)卵泡發(fā)育的作用，說明地黃的寒熱藥性會(huì)影響地黃對(duì)卵巢排卵的作用。九曬熟地組小鼠卵巢組織FSHR表達(dá)高于空白組、生地組、一曬熟地組小鼠，提示FSHR可能是九曬熟地促進(jìn)排卵的靶點(diǎn)之一。

炮制改變中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，為探究九曬熟地中區(qū)別于生地、一曬熟地的溫性成分，本研究采用了色譜法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法。該方法是利用降維的思想，根據(jù)化合物的色譜信息，選取與化合物最相關(guān)的特征來參與分類，能夠最大程度簡(jiǎn)化具有眾多復(fù)雜化學(xué)變量的樣本[11]。結(jié)果顯示1～4號(hào)峰、6號(hào)峰為九曬熟地區(qū)別于生地、一曬熟地的主要差異成分。1～4號(hào)峰其隨炮制程度加深而增加，在九曬熟地中含量最高，可能為九曬熟地中的溫性成分，其中1號(hào)峰為5-羥甲基糠醛。5-羥甲基糠醛是由糖類、氨基酸在炮制過程中經(jīng)美拉德反應(yīng)生成的化合物，如黨參[12]、女貞子[13]等藥材經(jīng)過炮制后5-羥甲基糠醛含量增加，其被認(rèn)為可能是引起這些中藥炮制前后寒熱藥性發(fā)生改變的成分之一。

綜上所述，不同炮制程度地黃寒熱藥性不同，對(duì)卵泡發(fā)育的影響不同，九曬熟地性溫，能促進(jìn)卵泡發(fā)育，F(xiàn)SHR為其作用靶點(diǎn)之一，5-羥甲基糠醛可能為九曬熟地區(qū)別于生地、一曬熟地的溫性成分之一。