段志穎， 童星麗， 黃紫微， 談 勇*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

反復(fù)流產(chǎn)即復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion, RSA)是指同一性伴侶情況下連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)，但大多數(shù)專家認(rèn)為因連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)的患者再次發(fā)生流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)與3次者相近，也應(yīng)重視并給予評(píng)估[1]。RSA相當(dāng)于祖國醫(yī)學(xué)的“墮胎”、“滑胎”，其病因復(fù)雜多樣且缺乏特異性臨床表現(xiàn)，是婦科臨床常見的不良妊娠現(xiàn)象，也屬于臨床治療的疑難病之一。

妊娠期間，胎盤的血液供應(yīng)影響著胎兒的正常生長發(fā)育。妊娠期高凝狀態(tài)會(huì)改變子宮胎盤部位血流狀態(tài)，使之血液供應(yīng)下降，致使胚胎或胎兒缺血缺氧，最終導(dǎo)致胚胎或胎兒的發(fā)育不良而流產(chǎn)[2-3]。Motha等[4]提出反復(fù)妊娠丟失與血栓性疾病或凝血功能紊亂有關(guān)。也有研究表明，臨床上采取常規(guī)保胎方案聯(lián)合活血化瘀可以提高其臨床療效[5-6]。膜聯(lián)蛋白V即Annexin V(胎盤抗凝蛋白I或血管抗凝劑，Annexin A5/AnxA5)存在胎盤和血管內(nèi)皮等組織中，它具有強(qiáng)大的抗凝血性能，這是由于它對(duì)陰離子磷脂具有很高的親和力，并有能力從磷脂中取代凝血因子[7-8]。AnxA5表達(dá)也與子癇前期和胎兒生長受限相關(guān)，其中AnxA5主要是能夠與這些促凝表面的結(jié)合而維持血流，并通過維持胎盤的血流來提高胎兒的存活能力[9]。Ueki等[10]提出母親AnxA5在懷孕期間充當(dāng)抗血栓形成劑，并指出母體的AnxA5缺失時(shí)會(huì)丟失胎兒。本文旨在探討AnxA5與RSA的相關(guān)性和丹參酮ⅡA對(duì)RSA小鼠的影響，以期為相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雌性CBA/J小鼠55只、雄性DBA/2小鼠15只、雄性BALB/c小鼠5只，均為6～8周齡，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2018-0006，動(dòng)物合格證號(hào)分別為20130016009951、20180006001844，自由飲水?dāng)z食，飼養(yǎng)在南京中醫(yī)藥大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度50%～70%，晝夜各12 h。

1.2 試劑和儀器 丹參酮ⅡA對(duì)照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，純度99.13%，批號(hào)568-72-9)。阿司匹林(江蘇省中醫(yī)院，批號(hào)HI3023635)；戊巴比妥納(美國Sigma公司，批號(hào)U48297)。二甲基亞砜(德國BioFROXX公司，批號(hào)67.68.5)；羥甲基纖維素鈉(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)9085-26-1)；多聚甲醛(成都中科唯實(shí)儀器有限責(zé)任公司，批號(hào)Q/C5411196-9)；凝血酶原(progesterone,PT)、雌激素(estradiol,E2)、孕激素(prothrombin,P)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(北京安迪華泰科技有限公司，規(guī)格96T，批號(hào)分別為AD3424Mo、AD3212Mo、AD1795Mo)；兔抗AnxA5抗體(美國Signalway Antibody公司，批號(hào)31009)；抗β-actin抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)bs-0061R)；辣根過氧化物酶(horseradish Peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗(美國Cell Signaling Technology公司，批號(hào)7074P2)；Western blot試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0012A)；JB-P5石蠟包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)。

1.3 模型建立 參照文獻(xiàn)[11]，采用CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠交配組合，作為RSA模型，操作方法為采取動(dòng)情前期或動(dòng)情期的CBA/J，分別與DBA/2、BALB/c合籠交配，檢出陰栓者或陰道涂片見精子者為妊娠。

1.4 分組及給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，其間進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，確認(rèn)雌性小鼠周期變化規(guī)律，選取動(dòng)情前期及動(dòng)情期的雌性CBA/J，分別與雄性DBA/2、BALB/c合籠交配, 建立RSA模型50只、正常妊娠模型10只，檢出陰栓者及陰道涂片見精子者為妊娠第0.5天[12]，開始用藥。

其中，CBA/J×BALB/c孕鼠作為正常組(n=10), CBA/J×DBA/2孕鼠RSA模型(n=50)按妊娠順序隨機(jī)分為模型組、西藥組(阿司匹林)、中西藥結(jié)合組(丹參酮ⅡA低劑量+阿司匹林)及低劑量組、中劑量組、高劑量組(丹參酮ⅡA)。阿司匹林劑量根據(jù)成人70 kg臨床用藥劑量75 mg/d，按動(dòng)物體表面積換算；丹參酮ⅡA參考文獻(xiàn)[13],低、中、高劑量組給藥劑量分別為12.5、25、50 mg/kg。因丹參酮ⅡA不易溶解，故用含0.4%二甲基亞砜、1%羥甲基纖維素鈉的蒸餾水配制，并置于超聲儀中助溶，而正常組、模型組給予相同體積含0.4%二甲基亞砜、1%羥甲基纖維素鈉的蒸餾水，灌胃量均為0.01 mL/g，自妊娠第0.5天開始灌胃，每天1次，連續(xù)14 d[12]。

1.5 標(biāo)本制備 末次灌胃后小鼠禁食24 h后，給予1.5%戊巴比妥鈉麻醉，眼眶采血，在室溫下靜置30 min后離心，收集上清，頸推脫臼處死，剖腹分離妊娠子宮，從子宮角處鈍性剖開子宮壁，將胚胎從著床部位剝離，眼科剪分離著床部位的蛻膜組織，預(yù)冷的PBS緩沖液或生理鹽水充分沖洗，濾紙吸凈，迅速置于液氮罐或4%多聚甲酵中固定保存。

1.6 免疫組化 4%多聚甲醛固定小鼠子宮蛻膜、胎盤組織，石蠟包埋，切片，脫蠟，進(jìn)行抗原修復(fù)，給予一抗AnxA5(1∶200)、二抗(HRP標(biāo)記)覆蓋，玻片洗滌后滴加顯色液，控制顯色時(shí)間，顯色后沖洗，Harris蘇木素復(fù)染后再?zèng)_洗，脫水晾干，封片，在顯微鏡下進(jìn)行圖像采集，每組選取6張切片，每張隨機(jī)觀察3個(gè)視野，采用Image-Pro Plus軟件分析。

1.7 Western blot檢測(cè) 提取凍存的小鼠子宮蛻膜組織、胎盤標(biāo)本，蛋白定量變性后，10%SDS-PAGE凝膠電泳1.2 h，半干轉(zhuǎn)30 min，在室溫下封閉1 h，4 ℃下孵育一抗(β-actin 1∶1 000、Anxa5 1∶1 000)過夜，洗膜，室溫孵育二抗(1∶2 000)1 h，曝光，采用Image J軟件測(cè)定目的條帶OD值，以β-actin為內(nèi)參，目的條帶OD值/β-actinOD值為目的蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 胚胎丟失率 參考文獻(xiàn)[12-14]計(jì)算丟失率，結(jié)果如圖1所示，可知正常組胚胎丟失率較低，在10%以下，而模型組接近40%，高于正常組(P<0.01)；與模型組比較，給藥組胚胎丟失率降低(P<0.05，P<0.01)，以高劑量組最明顯。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 小鼠血清指標(biāo) 由表1可見，正常組、模型組小鼠血清PT、E2、P水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，給藥組小鼠血清PT水平降低(P<0.05)。

表1 各組小鼠血清PT、E2、P水平

2.3 小鼠子宮蛻膜組織、胎盤AnxA5表達(dá) 如圖2、表2所示，與正常組比較，模型組小鼠AnxA5表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，給藥組AnxA5表達(dá)有不同程度的提高(P>0.05)。如表3、圖3所示，與模型組比較，給藥組(除低劑量組外)小鼠子宮蛻膜組織AnxA5表達(dá)升高(P<0.05)，中西藥結(jié)合組、高劑量組小鼠胎盤組織其表達(dá)升高(P<0.05)。

圖2 各組小鼠子宮蛻膜組織、胎盤AnxA5表達(dá)(Ⅰ)

表2 各組小鼠子宮蛻膜組織、胎盤AnxA5表達(dá)的OD值

圖3 各組小鼠子宮蛻膜組織、胎盤AnxA5表達(dá)(Ⅱ)(×200)

表3 各組小鼠子宮蛻膜組織、胎盤Anxa5表達(dá)的OD值

3 討論

丹參素有“功同四物”之稱，具有活血祛瘀等功效，宋代陳自明的《婦人大全良方》中曾指出其能破宿血，生新血，安生胎，治療產(chǎn)前胎動(dòng)不安。丹參具有促進(jìn)纖溶、降低血小板粘附及聚集等功能[15-16]。隨著對(duì)丹參藥理作用的不斷研究，丹參提取物丹參酮ⅡA的作用也有了深層次的發(fā)現(xiàn)，研究表明丹參酮ⅡA改善血液循環(huán)抗凝、抗血小板聚集、改善血液流變學(xué)特性及改善微循環(huán)等多種藥理作用[17-21]。

膜聯(lián)蛋白A5是屬于參與細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的一種蛋白質(zhì)家族，主要為各組織提供營養(yǎng)，且具有抗血栓形成、抗凋亡和抗炎的特性[8, 22]。AnxA5在妊娠時(shí)期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)豐富，可與胎盤絨毛細(xì)胞膜表面的磷脂相結(jié)合，形成一道保護(hù)屏障使凝血因子復(fù)合物合成受阻，從而起到抗凝效果而維持正常妊娠[23-24]。當(dāng)這種屏障被破壞或AnxA5表達(dá)減少，就可能會(huì)發(fā)生流產(chǎn)。反復(fù)流產(chǎn)與胎盤和子宮蛻膜上的AnxA5表達(dá)有關(guān)，表達(dá)較低或其抗凝血或結(jié)合活性受阻，均可導(dǎo)自然妊娠丟失[25]。此外，AnxA5高表達(dá)可維持血液流動(dòng)性，可能在預(yù)防血小板活化異常中起作用，子宮或胎盤AnxA5表達(dá)可以預(yù)防血栓形成，從而維持整個(gè)妊娠時(shí)期[25-26]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組胚胎丟失率及血清PT水平上升，但各個(gè)干預(yù)組胚胎丟失率及PT水平均有不同程度的改善；模型組小鼠子宮蛻膜、胎盤組織AnxA5較低，而各個(gè)干預(yù)組小鼠子宮蛻膜、胎盤組織AnxA5均有不同程度的提升?？梢姷⑼駻可能通過提高子宮蛻膜組織或胎盤組織中AnxA5表達(dá)從而維護(hù)其所形成的保護(hù)性屏障，起到抗凝維持妊娠的作用。母體妊娠子宮、胎盤AnxA5的存在，使胎盤血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)和胎兒丟失風(fēng)險(xiǎn)降低，從而改善妊娠結(jié)局。同時(shí)丹參酮ⅡA還可以通過降低妊娠小鼠血清凝血酶原的水平,從而抑制血小板聚集，改善血凝狀態(tài)，改善小鼠妊娠結(jié)局。

綜上所述，丹參酮ⅡA可能通過降低血清凝血酶原，增加子宮、胎盤AnxA5表達(dá)，改善孕鼠高凝狀態(tài)，從而降低胚胎丟失率。但其更多潛在的藥理作用及作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，可從細(xì)胞生物學(xué)等角度更深入的研究來解釋丹參酮ⅡA在反復(fù)流產(chǎn)的應(yīng)用原理。