區(qū)作明， 劉效仿， 李 雪， 陳 茹， 鄧向亮， 張念軍*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬佛山市中醫(yī)院骨科,廣東 佛山 528000；2.佛山市高明區(qū)中醫(yī)院骨科,廣東 佛山 528500；3.南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院中醫(yī)科,廣東 佛山 528300；4.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院及附屬第二醫(yī)院,廣東 云浮 527300)

骨寶丸由熟地、仙茅、山萸肉等十多種中藥組成，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、健脾胃、益氣血的功效，是佛山市中醫(yī)院的院內(nèi)制劑[1]。三十余年臨床應(yīng)用結(jié)果表明骨寶丸對骨質(zhì)疏松、骨折愈合遲緩、股骨頭無菌性壞死及肝腎虧損諸癥，均有較為理想的臨床療效[1-4]。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨骼系統(tǒng)疾病，常見于中老年人，特別是絕經(jīng)后女性，隨著我國人口老齡化到來，預(yù)測我國骨質(zhì)疏松患者約占世界50%[5-6]。骨質(zhì)疏松形成的機(jī)制之一是骨吸收與骨形成之間的動態(tài)失衡，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，破壞了兩者共同維持的骨質(zhì)及骨量的平衡。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在骨吸收和骨形成的偶聯(lián)中起著關(guān)鍵性的作用，其中核因子κB受體活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB，RANK)與其配體RANKL(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)結(jié)合具有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化及骨吸收的形成的作用；而骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)則與RANK競爭性結(jié)合RANKL，從而抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡[7-8]。骨寶丸治療骨質(zhì)疏松療效顯著，但是其相關(guān)作用機(jī)制尚未完全清楚，本研究考察骨寶丸對骨質(zhì)疏松小鼠OPG/RANKL通路的影響，從骨寶丸干預(yù)骨吸收的角度探討其潛在的作用機(jī)制，為其在臨床上進(jìn)一步的推廣和使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雌性BALB/c小鼠30只，體質(zhì)量(20±2)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2013-0002，飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室。

1.2 藥物 骨寶丸(粵藥制字Z20060052)由淫羊藿、龜板膠、鹿角膠、熟地、當(dāng)歸、淮山藥、山茱萸肉、杜仲、川芎、黃芪、仙茅、紅參組成，上述藥材經(jīng)清洗、烘干、粉碎后制備成糊丸(小丸)，小袋密封保存，每袋6 g。TLC檢測黃芪、熟地黃、當(dāng)歸、川芎有效成分時，可作為該制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[9]。

1.3 試劑與儀器 維甲酸(大連美侖生物科技有限公司)；免疫組化二抗試劑盒(美國Cell Signaling Technology公司)；兔來源的OPG和RANKL一抗、OPG ELISA Kit(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；RANKL ELISA Kit(武漢華美生物工程有限公司)。L535R型臺式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；Multiskan FC酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；BX53型倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 分組、造模與給藥 小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組及骨寶丸高劑量組(6 g/kg)、中劑量組(3 g/kg)、低劑量組(1.5 g/kg)，每組6只。除正常組外，其余小鼠灌胃給予維甲酸(100 mg/kg)，每天1次，連續(xù)30 d；骨寶丸各劑量組小鼠灌胃給予相應(yīng)藥液(骨寶丸研磨成粉狀，加入水制成混懸液，劑量0.2 mL/10 g)，每天1次，連續(xù)30 d，按成人劑量的10倍劑量作為給藥中劑量(即3 g/kg)，同法得到高劑量(6 g/kg)、低劑量(1.5 g/kg)。

1.5 HE染色 將小鼠股骨置于10%中性甲醛溶液中固定48 h，脫鈣液脫鈣，制作股骨頭橫切面的石蠟切片，進(jìn)行HE染色。

1.6 股骨生物力學(xué)檢測 將小鼠左側(cè)股骨用10%中性甲醛溶液固定，委托廣州元合生物科技有限公司進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實驗，檢測最大值載荷和最大值彎曲應(yīng)力。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實驗 取小鼠外周血，離心分離血清，按照ELISA試劑盒方法檢測血清中OPG、RANKL水平。

1.8 免疫組化 按“1.5”項下方法處理小鼠股骨后制作石蠟切片，采用免疫組化法檢測骨組織OPG、RANKL分泌。為排除免疫組化的非特異性染色，設(shè)置陰性對照組，即采用磷酸鹽緩沖液代替一抗溶液與該組織孵育，其余操作同各實驗組。

2 結(jié)果

2.1 對小鼠股骨生物力學(xué)的影響 與正常組比較，模型組小鼠最大值彎曲應(yīng)力(圖1A)、最大值載荷(圖1B)均降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，骨寶丸各劑量組小鼠最大值彎曲應(yīng)力、最大值載荷均有不同程度升高，以中、高劑量更明顯(P<0.05，P<0.01)。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 對小鼠股骨頭組織結(jié)構(gòu)的影響 如圖2所示，模型組小鼠股骨頭體積縮小，骨髓腔明顯小于正常組，骨髓內(nèi)容物減少，這與肉眼觀察到的股骨頭變小、股骨體色澤枯白的情況一致；與模型組比較，肉眼觀察到骨寶丸各劑量組小鼠股骨頭粗壯，其中高劑量組與正常組無顯著差異，股骨體顯現(xiàn)隱隱的紅潤光澤，而在顯微鏡下觀察骨寶丸各劑量組小鼠骨髓腔大于模型組，骨髓內(nèi)容物增加。

圖2 小鼠股骨頭HE染色(×100)

2.3 對小鼠血清OPG、RANKL分泌的影響 如圖3A～3C所示，與正常組比較，模型組小鼠血清中OPG水平較正常組有降低的趨勢，RANKL水平升高(P<0.01)，模型組小鼠OPG/RANKL比值降低(P<0.01)；與模型組比較，骨寶丸各劑量組小鼠血清RANKL水平降低(P<0.05)，而OPG水平較模型組有升高的趨勢，骨寶丸各劑量組小鼠OPG/RANKL比值升高(P<0.05，P<0.01)。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 對小鼠股骨組織OPG、RANKL分泌的影響 如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠股骨組織OPG分泌減少，RANKL分泌增加；與模型組比較，骨寶丸高劑量組小鼠股骨組織OPG分泌增加，RANKL分泌減少。

注：紅色箭頭所指灰棕色處為組織分泌的OPG或RANKL。

3 討論

本研究結(jié)果表明骨寶丸可以拮抗維甲酸誘導(dǎo)的小鼠股骨最大值彎曲應(yīng)力和最大值載荷減少以及骨髓組織微結(jié)構(gòu)的改變，并且對小鼠血清和骨組織OPG/RANKL有調(diào)節(jié)作用。

骨質(zhì)疏松的動物模型有多種造模方法，其中維甲酸造模具有簡便、成功率高、動物無死亡等優(yōu)勢，因此本研究參考文獻(xiàn)[8]選用維甲酸誘導(dǎo)小鼠制備骨質(zhì)疏松模型。骨質(zhì)疏松會導(dǎo)致機(jī)體骨生物力學(xué)發(fā)生顯著改變，例如骨的最大值彎曲應(yīng)力和最大值載荷降低，這也是骨質(zhì)疏松患者容易出現(xiàn)骨折的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)骨寶丸顯著拮抗維甲酸誘導(dǎo)小鼠股骨的最大值彎曲應(yīng)力和最大值載荷的降低，提示骨寶丸對小鼠骨質(zhì)疏松有顯著防治作用。結(jié)果與文獻(xiàn)[8]報道骨寶丸顯著增加去除卵巢的骨質(zhì)疏松大鼠脛骨的抗彎程度和彈性模量、剛性系數(shù)、韌性系數(shù)相一致。中醫(yī)理論認(rèn)為“腎主骨生髓”，類似的補(bǔ)腎益精中藥阿膠補(bǔ)腎健骨方對去勢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度、最大載荷和最大值彎曲應(yīng)力均有提高[10]，這提示骨寶丸治療骨質(zhì)疏松與其“補(bǔ)腎”功能密切相關(guān)，而本研究的HE染色結(jié)果還顯示骨寶丸可以顯著增加骨質(zhì)疏松小鼠骨髓內(nèi)容物，該結(jié)果為上述觀點(diǎn)提供了支持。

為了進(jìn)一步談探討骨寶丸防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制，考察了骨寶丸對維甲酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松小鼠OPG/RANKL的影響。結(jié)果顯示，維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠血清和骨組織RANKL分泌水平升高，而OPG在骨組織分泌水平降低、在血清中有下降的趨勢；同時OPG/RANKL的比值降低。骨寶丸干預(yù)可以明顯改善小鼠上述指標(biāo)的變化，即對維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠OPG/RANKL通路有顯著調(diào)節(jié)作用。骨骼是一個高重建的器官，具有持續(xù)重塑周期，其中骨形成和骨吸收這組偶聯(lián)處于動態(tài)更新、共同維持骨質(zhì)及骨量的平衡。研究表明OPG基因剔除的小鼠表現(xiàn)為破骨細(xì)胞分化活躍和骨吸收增強(qiáng)，出現(xiàn)嚴(yán)重骨質(zhì)疏松[11-13]；RANKL可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)成熟破骨細(xì)胞的活力，阻止破骨細(xì)胞凋亡，是破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵刺激因子，而RANK在破骨前體細(xì)胞或成熟破骨細(xì)胞表面高度表達(dá)，是目前發(fā)現(xiàn)的RANKL的唯一靶受體[14-15]。體內(nèi)骨量的改變和體外破骨細(xì)胞的形成取決于RANKL與OPG的比值，即骨形成還是骨吸收，若OPG基因表達(dá)高于RANKL，則破骨細(xì)胞形成受抑制；相反，若OPG基因表達(dá)低于RANKL，則破骨細(xì)胞形成活躍[7]。因此，本實驗結(jié)果提示，骨寶丸防治骨質(zhì)疏松的機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)OPG/RANKL通路進(jìn)而抑制過強(qiáng)的骨吸收相關(guān)。

綜合上述，本研究結(jié)果表明骨寶丸對維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠OPG/RANKL通路有調(diào)節(jié)作用，這可能是其防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制之一。