謝 君， 蘆 波， 李建華， 桂明泰， 姚 磊， 周訓(xùn)杰， 符德玉*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437)

早期再灌注治療是治療心肌梗死的有效策略，但再灌注過程可誘發(fā)心肌缺血再灌注損傷(Ischemia/Reperfusion injury，I/R)，它涉及復(fù)雜的病理生理過程，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激是缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/Reoxygenation，H/R)極為重要的病理基礎(chǔ)，其過程與GPX1等蛋白的異?；罨芮邢嚓P(guān)[3-4]。

丹參及其活性成分在臨床上被廣泛用于治療心腦血管缺血性疾病，療效顯著，可通過抗氧化、減輕炎癥反應(yīng)、清除自由基等作用來減輕心肌H/R損傷[5-6]，但是否能通過GPX1通路調(diào)控氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)探討丹參噴干粉對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞 H9c2心肌細(xì)胞、293T人腎上皮細(xì)胞(美國(guó) ATCC細(xì)胞庫(kù))。

1.2 藥物和試劑 丹參噴干粉(雷氏丹參片，上海雷允上藥業(yè)有限公司，批號(hào)Z31020192)。CCK8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒、羊抗兔HRP標(biāo)記二抗、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)C0037、C1062L、S0033、A0208、A0216)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)16000-044)；DEME培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司，批號(hào)SH30243.01)；N-乙酰半胱氨酸(NAC)(美國(guó)MCE公司，貨號(hào)HY-B0215)；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)T1300-100)；丙二醛(MDA)檢測(cè)盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)A003-1、A001-3)；GPX1抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)bs-3882R)；cleaved caspase3、cleaved PARP(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab2302、ab32064)；GAPDH(美國(guó)CST公司，貨號(hào)5174)；Trizol(美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)1596-026)；SYBR Green PCR試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司，貨號(hào)K0223)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermentas公司，貨號(hào)K1622)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 H9c2細(xì)胞采用含10%胎牛血清、1%雙抗(青鏈霉素混合液)的DMEM培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)為貼壁細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)加入0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。使用慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)GPX1，插入載體質(zhì)粒pLVX-Puro及包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2G轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后獲得高滴度重組慢病毒。將細(xì)胞培養(yǎng)于含oeGPX1慢病毒的DMEM中培養(yǎng)12 h，在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染相應(yīng)的shRNA。采用Western blot法，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

2.2 細(xì)胞處理及分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，接種于96孔板(100 μL/孔)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合度時(shí)進(jìn)行H/R處理。將培養(yǎng)液更換為無血清/無糖DMEM，置于37 ℃、94% N2、1% O2、5% CO2培養(yǎng)箱中缺氧處理5 h，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中復(fù)氧(5% CO2，95% O2)培養(yǎng)1 h，不同質(zhì)量濃度(0.1、0.5 μg/mL)丹參噴干粉培養(yǎng)H9c2細(xì)胞24 h，以正常條件下培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照。然后，將H9c2細(xì)胞分為對(duì)照組、H/R組、H/R+0.1 μg/mL丹參噴干粉組、H/R+0.5 μg/mL丹參噴干粉組、H/R+N-乙酰半胱氨酸組。

2.3 CCK8檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞收集離心，重懸后顯微鏡下計(jì)數(shù)，接種至96孔培養(yǎng)板，每孔3×103個(gè)細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃下培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、2%、2.5%、5%、10%、20%、50%、0.1%、0.5%)丹參噴干粉處理H9c2細(xì)胞，分別在0、24、48、72 h后吸去上清，按1∶10比例混合CCK-8和無血清必需基本培養(yǎng)基，每孔100 μL，加入96孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為存活率=[(檢測(cè)組OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照組OD值-空白孔OD值)]×100%。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取1×105個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入10 μL Annexin V-FITC后混勻，再加入5 μL碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，置于冰浴中，以不加AnnexinV-FITC及PI的檢測(cè)管作為陰性對(duì)照，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.5 MDA水平、SOD活性檢測(cè) 分別用黃嘌呤氧化酶法、TBA法檢測(cè)細(xì)胞SOD活性、MDA水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

2.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) H9c2細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入含蛋白酶、磷酸酶抑制劑的裂解液，在4 ℃下充分裂解，將細(xì)胞刮入1.5 mL EP管中，95 ℃以上加熱10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，進(jìn)行蛋白定量。將配制好的PAGE膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液，將樣品加到上樣孔，濃縮膠在80 V下電泳20 min，分離膠在120 V下電泳60 min。將PVDF膜在甲醇中浸泡1～2 min，再孵育于冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中5 min，凝膠在冰冷電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡3～5 min，轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗GPX1(1∶1 000)、cleaved-caspase3(1∶5 000)、cleaved-PARP(1∶2 000)、GAPDH(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次后，按1∶1 000比例稀釋HRP標(biāo)記的二抗，在37 ℃下孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min，配制ECL發(fā)光液，取A和B等量混勻，加在膜正面，暗室避光5 min，倒掉顯色液，用紙吸取，在上面蓋上1層平整透明紙，將其放入成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描。

2.7 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中GPX1 mRNA的表達(dá) 使用Trizol試劑采集H9c2細(xì)胞總RNA，用cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green Mix，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)?5 ℃ 10 s，40個(gè)周期，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s。以GAPDH為內(nèi)參，GPX1正向引物5′-TCACCCGCTCTTTACCTTC-3′，反向引物5′-AACACCGTCTGGACCTACC-3′；GAPDH正向引物5′-GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC-3′，反向引物5′-ATGAGCCCTTCCACGATGC-3′。

3 結(jié)果

3.1 H/R處理對(duì)H9c2細(xì)胞中GPX1表達(dá)的影響 圖1A～1B顯示，與對(duì)照組比較，H/R組細(xì)胞中GPX1的蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。圖1C顯示，與對(duì)照組比較，H/R組細(xì)胞中GPX1的mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01。

3.2 丹參噴干粉對(duì)H/R處理H9c2細(xì)胞的增殖和GPX1表達(dá)的影響 圖2A顯示，與對(duì)照組比較，H/R組H9c2細(xì)胞增殖下降(P<0.01)；與H/R組比較，0.1、0.5 μg/mL丹參噴干粉處理后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用明顯(P<0.01)，因此選擇這2種質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖2B～2D顯示，與H/R組比較，丹參噴干粉能提高H/R處理H9c2細(xì)胞中GPX1表達(dá)(P<0.01)，在0.5 μg/mL下效果更強(qiáng)。為探究GPX1的具體作用機(jī)制，加入ROS抑制劑NAC，發(fā)現(xiàn)與H/R組比較，加入ROS抑制劑后H9c2細(xì)胞中GPX1表達(dá)增高(P<0.01)，說明GPX1是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與H/R組比較，##P<0.01；與H/R+0.1 μg/mL丹參噴干粉組比較，△△P<0.01；與H/R+0.5 μg/mL丹參噴干粉組比較，●●P<0.01。

3.3 丹參噴干粉對(duì)H/R處理H9c2細(xì)胞凋亡的影響 圖3顯示，與對(duì)照組比較，H/R處理后的H9c2細(xì)胞凋亡率上升(P<0.01)，而丹參噴干粉預(yù)處理能降低 H/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平(P<0.01)，并且質(zhì)量濃度越高，作用效果越強(qiáng)。此外，ROS抑制劑NAC也能降低H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平(P<0.01)。

注：A為丹參噴干粉對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，B為細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)圖。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與H/R組比較，##P<0.01；與H/R+0.1 μg/mL丹參噴干粉組比較，△△P<0.01；與H/R+0.5 μg/mL丹參噴干粉組比較，●●P<0.01。

3.4 丹參噴干粉對(duì)H/R處理H9c2細(xì)胞的ROS水平和抗氧化影響 圖4顯示，與對(duì)照組比較，H/R組ROS、MDA水平升高(P<0.01)，而ROS抑制劑NAC及丹參噴干粉能降低ROS水平(P<0.01)。與對(duì)照組比較，H/R組SOD水平降低(P<0.01)，而ROS抑制劑NAC及丹參噴干粉能增加SOD水平(P<0.01)。

注：A為丹參噴干粉對(duì)ROS的影響，B為ROS計(jì)數(shù)，C為丹參噴干粉對(duì)SOD的影響，D為丹參噴干粉對(duì)MDA的影響。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與H/R組比較，#P<0.05，##P<0.01；與H/R+0.1 μg/mL丹參噴干粉組比較，△△P<0.01；與H/R+0.5 μg/mL丹參噴干粉組比較，●●P<0.01。

3.5 丹參噴干粉以及oeGPX1對(duì)H/R誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞的相關(guān)蛋白影響 圖5顯示，與H/R組比較，過表達(dá)GPX1后GPX1表達(dá)增高(P<0.01)；H/R+oeGPX1+丹參噴干粉組GPX1表達(dá)更高(P<0.01)。與H/R組比較，H/R+oeGPX1組cleaved-caspase3、cleaved-PARP表達(dá)降低(P<0.01)；H/R+oeGPX1+丹參噴干粉組cleaved-caspase3、cleaved-PARP表達(dá)更低(P<0.01)。

注：A為丹參噴干粉及oeGPX1對(duì)相關(guān)蛋白的影響，B為丹參噴干粉及oeGPX1相關(guān)蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與H/R+oeGPX1組比較，##P<0.01。

3.6 丹參噴干粉對(duì)oeGPX1緩解H/R誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷的影響 圖6顯示，與H/R組比較，H/R+oeGPX1組ROS及細(xì)胞凋亡水平降低(P<0.01)；H/R+oeGPX1+丹參噴干粉組降低程度更明顯(P<0.01)。

4 討論

GPX1是參與主要抗氧化分子谷胱甘肽的抗氧化系統(tǒng)中最重要的成分之一，通過降低氧化應(yīng)激來抑制細(xì)胞凋亡[7]。GPX1表達(dá)的改變或異常與心血管疾病、神經(jīng)退行性變、自身免疫性疾病等疾病的病因密切相關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧刺激使H9c2心肌細(xì)胞的GPX1表達(dá)降低，氧化應(yīng)激水平及細(xì)胞凋亡率增加；給予丹參噴干粉或ROS抑制劑預(yù)處理后，心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)活性增加，凋亡率降低，此外，丹參噴干粉協(xié)助oeGPX1來緩解H/R誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷，表明丹參噴干粉抑制心肌細(xì)胞凋亡及抗氧化的作用是通過GPX1實(shí)現(xiàn)的。

丹參化合物具有良好的抗氧化、抗炎、抗血栓、心臟保護(hù)活性等多種生物活性[9]，因此在臨床是被廣泛用于治療心腦血管疾病。如Zhang等[10]研究證明丹參注射液能夠逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激標(biāo)志物SOD活性、MDA水平的變化，發(fā)揮保護(hù)小鼠心肌細(xì)胞作用。Ai等[11]研究發(fā)現(xiàn)，丹參腹腔注射4周，能夠改善心肌梗死模型大鼠心肌血管受損情況，改善射血分?jǐn)?shù)(EF)和縮短分?jǐn)?shù)(FS)的作用，表明其具有改善心功能的作用。Huang等[12]發(fā)現(xiàn)丹參川芎嗪注射液可保護(hù)冠狀動(dòng)脈閉塞和再灌注2 h小鼠心肌缺血/再灌注(I/R)和缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷，降低MDA水平，增加SOD活性。體外實(shí)驗(yàn)證明，用丹參川芎嗪處理H9c2細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡受到抑制，caspase-3表達(dá)降低，Bcl-2/Bax比值升高。

多項(xiàng)研究證明細(xì)胞凋亡參與心肌缺血再灌注過程，抑制細(xì)胞凋亡成為治療心肌缺血再灌注手段之一。而氧化應(yīng)激是H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13]的重要機(jī)制。H/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的主要機(jī)制是通過細(xì)胞內(nèi)大量ROS的積累，破壞細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化活性之間的平衡。ROS的積累損傷膜上的磷脂和脂蛋白，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而通過傳遞鏈反應(yīng)[14]損傷DNA。細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激可導(dǎo)致氧化損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，H/R刺激后H9c2 心肌細(xì)胞凋亡率增加，丹參噴干粉及ROS抑制劑的預(yù)處理能降低心肌細(xì)胞凋亡率。此外，過表達(dá)GPX1及丹參噴干粉處理能夠降低凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3、cleaved-PARP表達(dá)，這表明了丹參噴干粉對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用是通過調(diào)控關(guān)鍵基因GPX1實(shí)現(xiàn)的。

心肌缺血再灌注加速氧化代謝并產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致細(xì)胞退化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞ROS水平升高，伴隨SOD活性降低?？寡趸瘎┩ㄟ^誘導(dǎo)參與細(xì)胞保護(hù)的基因表達(dá)來清除ROS，活性氧自由基的產(chǎn)生需要SOD的誘導(dǎo)并伴隨GPX1的增加，這與本研究結(jié)果一致。有報(bào)道，高同型半胱氨酸血癥可降低GPX1表達(dá)[16]，這是心血管疾病的危險(xiǎn)因素。因此，疾病特異性基因的改變可能導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生，GPX1的上調(diào)可能有助于減緩疾病的進(jìn)程。

GPX1在氧化應(yīng)激中發(fā)揮著雙重作用。本實(shí)驗(yàn)證明了GPX1在氧化應(yīng)激反應(yīng)下對(duì)心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。然而，GPX1敲除小鼠更容易受到嚴(yán)重的急性氧化應(yīng)激，而過表達(dá)GPX1則更容易獲得額外的保護(hù)作用[17]。異常情況下，GPX1的過量導(dǎo)致細(xì)胞缺乏必要的氧化劑，因而產(chǎn)生有害影響[18-19]，這會(huì)導(dǎo)致以缺乏氧化劑和/或過量還原劑為特征的還原應(yīng)激[20-21]。因此，未來仍需要更多的研究來進(jìn)一步研究GPX1在氧化還原反應(yīng)中的復(fù)雜調(diào)控以及其在相關(guān)疾病中的潛在應(yīng)用。