胡雪黎， 文德鑒， 涂 星， 楊士林， 楊 寶， 胡澤華,3*

[1.風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族大學(xué))，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000；3.湖北民族大學(xué)武陵山中藥材檢驗(yàn)檢測中心，湖北 恩施 445000]

盆炎清栓收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》，是由吲哚美辛和毛冬青提取物組成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，主要用于治療盆腔炎等疾病[1]，能顯著降低抗生素的耐藥性和盆腔炎的復(fù)發(fā)率[2-3]。但目前相關(guān)文獻(xiàn)僅報(bào)道了采用RP-HPLC法測定盆炎栓中吲哚美辛含量[1,4]，以及采用TLC法對該制劑中毛冬青提取物進(jìn)行定性鑒別[1]，而盆炎清栓化學(xué)成分復(fù)雜，藥效發(fā)揮可能是多成分協(xié)同作用的結(jié)果，故僅測定上述指標(biāo)無法全面控制其質(zhì)量。

中藥及其復(fù)方制劑的化學(xué)成分研究主要是采用傳統(tǒng)的色譜法分離，再通過核磁共振波譜法鑒定結(jié)構(gòu)，雖然所得結(jié)果較準(zhǔn)確，但實(shí)驗(yàn)周期長，鑒定化合物少，難以快速全面地對其進(jìn)行表征。超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q/TOF-MS/MS)是一種結(jié)合了高效分離和高通量定性、定量的技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于中藥成分分析[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)首次采用UPLC-Q/TOF-MS/MS法鑒定盆炎清栓化學(xué)成分，并測定蘆丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料

LC-30A高效液相色譜儀(日本島津公司)；AB Sciex TripleTOF5600+質(zhì)譜儀、PeakView 2.0軟件(美國AB Sciex公司)；ME104電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；TG16-W高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)；PS-40超聲波清洗機(jī)(深圳華泰超聲設(shè)備有限公司)。

盆炎清栓(批號(hào)190705、190501、200801、201003、200803、200902，黑龍江天辰藥業(yè)有限公司；批號(hào)200607、200601、191202，亞寶藥業(yè)四川制藥有限公司；批號(hào)19110701，瑞陽制藥有限公司)。吲哚美辛對照品(批號(hào)50826AS，大連美侖生物技術(shù)有限公司)，純度大于99.0%；蘆丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、冬青素A對照品均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)趙鐘祥教授提供，為前期從冬青屬植物及半邊旗中分離得到[6-9]，純度均大于90.0%(其中定量測定者大于98.0%)。甲醇、乙腈(德國默克公司)；甲酸(美國賽默飛世爾科技公司)。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜 Waters Acauity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；流動(dòng)相乙腈(含0.1%甲酸)(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脫(定性分析，0～5.0 min，5%～20%A；5.0～18.0 min，20%～45%A；18.0～23.0 min，45%～70%A；23.0～25.0 min，70%～100%A；25.0～28.0 min，100%A。定量測定，0～3.5 min，25%～30%A；3.5～7.0 min，30%～35%A；7.0～9.0 min，35%～50%A；9.0～11.0 min，50%～65%A；11.0～12.0 min，65%～75%A)；體積流量0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 ESI離子源；負(fù)離子模式(大部分成分在該模式下響應(yīng)顯著優(yōu)于在正離子模式下，而且在正離子模式下能進(jìn)行分析的離子在該模式下響應(yīng)也較好，故選擇其進(jìn)行分析)；氣簾氣30 psi(1 psi=6.895 kPa)；霧化氣、輔助加熱氣50 psi；離子源溫度550 ℃；噴霧電壓-4 500 V；去簇電壓110 V；碰撞能-45、-25 eV；一、二級(jí)掃描范圍m/z50～1 350；其他參數(shù)均為自動(dòng)優(yōu)化值。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液(定性分析) 稱取各對照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度為100～500 ng/mL的溶液，即得，在4 ℃下保存。

2.2.2 對照品溶液(定量測定) 精密稱取蘆丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A對照品適量，甲醇分別制成0.2、0.1、0.3、0.1、0.4、0.1、0.5、0.5 mg/mL貯備液，分別精密吸取300、300、125、300、1 050、900、1 600、1 250 μL，置于25 mL量瓶中，甲醇定容，即得(質(zhì)量濃度分別為2.4、1.2、1.5、1.2、16.8、3.6、32.0、25.0 μg/mL)，在4 ℃下保存。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取栓劑1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入45 mL甲醇，稱定質(zhì)量，在常溫下超聲提取30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，15 000 r/min離心15 min后用于定性分析，稀釋10倍后用于定量測定。

3 結(jié)果

3.1 化合物鑒定 共鑒定出91個(gè)化合物，包括54個(gè)三萜、22個(gè)苯丙素、9個(gè)黃酮、6個(gè)其他化合物，并通過相應(yīng)對照品驗(yàn)證了其中37個(gè)的結(jié)構(gòu)，具體見表1，總離子流圖見圖1。

圖1 盆炎清栓負(fù)離子模式總離子流圖

表1 盆炎清栓中化合物鑒定結(jié)果

3.1.1 三萜 該類成分基本上都以齊墩果烷或熊果烷為母核，結(jié)合C-3位羰基/羥基、C-4位醛基/羧基/羥甲基、C-17位羧基、C-19位羥基、C-19和C-20位雙鍵；糖基一般是葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸，通常以單糖鏈或雙糖鏈連接在苷元的C-3、C-23、C-24、C-28位；在ESI源負(fù)離子模式下的裂解行為高度相似，基本上都是先逐漸丟失全部糖基，得到苷元準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z501.32、487.34、485.32、471.34、469.33、455.35，再連續(xù)丟失H2O、CO2、HCOOH等，得到系列苷元碎片[5]。

以代表性成分毛冬青皂苷A1(60)、苷元冬青素A(86)為例，見圖2。兩者加合離子峰[M+HCOO]-分別為m/z709.38、547.33，前者先丟失一分子葡萄糖(m/z162)得到后者(m/z501.32[M-H]-)，再繼續(xù)發(fā)生中性丟失，得到系列碎片離子m/z483.31、457.33、439.32、421.31、395.33、377.32，其中m/z483.31、457.33分別為苷元丟失一分子H2O、CO2所產(chǎn)生，m/z439.32為碎片離子m/z483.31、457.33分別丟失一分子CO2、H2O所產(chǎn)生，m/z421.31、395.33為m/z439.321 7分別丟失一分子H2O、CO2所產(chǎn)生，m/z377.32為m/z421.31、395.33分別丟失一分子CO2、H2O所產(chǎn)生，由此可知苷元中含有2個(gè)羧基和2個(gè)羥基。冬青屬三萜類成分的羧基一般位于C-4、C-17位，羥基一般位于C-3、C-23、C-24、C-19位，故86可能是以齊墩果酸或者熊果酸為母核，結(jié)合C-4位羧基、C-19位羥基的化合物，而60的葡萄糖可能是與C-17位羧基形成酯鍵。通過與對照品比對，60、86分別被鑒定為毛冬青皂苷A1、冬青素A。

圖2 毛冬青皂苷A1(60)、冬青素A(86)裂解途徑

3.1.2 苯丙素 該類成分主要包括雙環(huán)氧木脂素、簡單苯丙素、咖啡?；崴?，其裂解方式一般是先發(fā)生苷鍵斷裂生成苷元碎片離子，后者再連續(xù)丟失H2O、CO2、CH3等產(chǎn)生系列碎片離子。其中，雙環(huán)氧木脂素、簡單苯丙素的質(zhì)譜鑒定過程見課題組前期研究結(jié)果[5]；咖啡?；崴嵩贓SI負(fù)離子模式下的的裂解方式主要是酰氧鍵、烷氧鍵斷裂，同時(shí)伴有中性丟失H2O、CO2等，如化合物2的碎片離子m/z191.05是母離子發(fā)生酰氧鍵斷裂生成的奎尼酸基團(tuán)，m/z179.04、135.05分別是母離子發(fā)生烷氧鍵斷裂生成的咖啡酸基團(tuán)、咖啡酸基團(tuán)脫去一分子CO2的產(chǎn)物，與文獻(xiàn)[10]比對后鑒定為綠原酸?；衔?4的質(zhì)譜行為與2相似，其特征性碎片離子分別是母離子斷裂1、2個(gè)酰氧鍵生成的單咖啡?；崴帷⒖崴崴槠?，與文獻(xiàn)[16]比對后鑒定為異綠原酸B。

3.1.3 黃酮 該類成分主要包括芹菜素、山柰酚、槲皮素及其氧苷，在ESI負(fù)離子模式下的質(zhì)譜裂解行為較為相似，大部分是先發(fā)生苷鍵連續(xù)的斷裂丟失糖基并生成苷元碎片離子，后者再發(fā)生中性丟失(CO2、CO、H2O、C2H2O等)，同時(shí)C環(huán)發(fā)生逆狄爾斯-阿爾德(RDA)裂解產(chǎn)生系列碎片離子，將其與相關(guān)文獻(xiàn)和對照品比對，結(jié)果見表1。

3.1.4 其他化合物 包括吲哚美辛、decumbic acid、橄欖苦苷及其同分異構(gòu)體、硬脂酸、棕櫚酸。

3.2 成分含量測定

3.2.1 專屬性試驗(yàn) 在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，蘆丁(20)、冬青苷O(37)、毛冬青皂苷B3(39)、毛冬青皂苷B2(59)、毛冬青皂苷A1(60)、毛冬青皂苷B1(62)、吲哚美辛(76)、冬青素A(86)在“2.1”項(xiàng)條件下母離子響應(yīng)較好，無明顯干擾，符合中藥有效成分定量測定要求，故選擇其作為指標(biāo)成分測定含量。取“2.2”項(xiàng)下對照品、供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖3，可知各成分分離度、響應(yīng)較好，在2種溶液中的色譜、質(zhì)譜行為一致。

20.蘆丁 37.冬青苷O 39.毛冬青皂苷B3 59.毛冬青皂苷B2 60.毛冬青皂苷A1 62.毛冬青皂苷B1 76.吲哚美辛 86.冬青素A

3.2.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液適量，甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。以峰面積(Y)對對照品質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，信噪比(S/N)=10為定量限，結(jié)果見表2，可知在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各指標(biāo)成分線性關(guān)系

3.2.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定6次，測得蘆丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A峰面積RSD分別為1.71%、1.18%、1.61%、1.08%、1.75%、0.65%、1.37%、1.86%，表明儀器精密度良好。

3.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取栓劑(190501)適量，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，測得蘆丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A峰面積RSD分別為1.41%、2.74%、2.65%、1.18%、0.93%、2.01%、2.89%、0.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品(190501)溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，測得蘆丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A峰面積RSD分別為1.38%、2.30%、1.53%、0.57%、0.68%、1.71%、1.26%、1.55%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取栓劑(190501)6份，每份0.5 g，加入“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，蘆丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A平均加樣回收率分別為101.42%、98.58%、97.84%、101.53%、103.04%、98.77%、101.95%、97.97%，RSD分別為1.53%、2.81%、2.48%、3.39%、2.21%、1.50%、2.74%、1.22%。

3.2.7 樣品含量測定 精密稱取10批栓劑，每批1.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 各指標(biāo)成分含量測定結(jié)果

4 討論

三萜是盆炎清栓中含量最高的一類成分，而且有一部分具有較好的抗炎活性，故測定其含量非常有必要。本實(shí)驗(yàn)從盆炎清栓中鑒定了91種成分，包括54個(gè)三萜、22個(gè)苯丙素、9個(gè)黃酮、6個(gè)其他類，采用對照品驗(yàn)證了其中37種的結(jié)構(gòu)，總結(jié)了三萜類、苯丙素類成分的裂解規(guī)律。再建立UPLC-MS法測定蘆丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A的含量，該方法分析時(shí)間短，靈敏度高，可為該制劑質(zhì)量控制提供簡單可行的方法，結(jié)果各成分在10批樣品中均能被檢出，同一廠家不同批次樣品中其含量差異較小，表明藥材投料一致；除吲哚美辛外，不同廠家樣品中部分成分含量差異較大，可能是藥材來源不一所致。

本實(shí)驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相[甲醇-水、乙腈-水、0.1%甲酸甲醇-水(含0.1%甲酸)、0.1%甲酸乙腈-水(含0.1%甲酸)]、色譜柱[Waters UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Waters UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)]對盆炎清栓中各成分分離度的影響，發(fā)現(xiàn)在Waters UPLC HSS T3柱、0.1%甲酸乙腈-水(含0.1%甲酸)條件下分離度最好，同分異構(gòu)體37、41、49、54能完全達(dá)到基線分離。再比較了甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇超聲提取20、30、40、50 min的效果，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取30 min時(shí)效率最高。