胡獻(xiàn)躍， 黃東緯， 陳笑笑， 朱興一

(1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321016；2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

續(xù)斷又名川斷、川續(xù)斷，《神農(nóng)本草經(jīng)》列其為治療骨折、骨質(zhì)疏松的上品，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折損等功效[1]，主要成分包括生物堿、揮發(fā)油、皂苷、環(huán)烯醚、萜糖苷、多糖等[2]，其中治療骨質(zhì)疏松的代表性化合物為續(xù)斷皂苷Ⅵ。研究表明，續(xù)斷皂苷Ⅵ可誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化[3]，能夠增加骨骼密度，改善骨小梁微觀結(jié)構(gòu)，有效防治骨質(zhì)疏松及其繼發(fā)性疾病[4]。

目前，續(xù)斷提取工藝以醇提法[5-6]為主，也有水提法[7-9]的報道，但水提物中續(xù)斷皂苷Ⅵ含量較低(34.9%)[9]，而在水飽和正丁醇中具有較高的溶解度。醇提后常用正丁醇萃取、水溶、石油醚脫脂、沉淀等工序，不僅消耗大量的機(jī)溶劑，并且提取過程時間長、次數(shù)多，導(dǎo)致能耗高、生產(chǎn)周期長、成本高昂。

離子液體是由陰陽離子組成的室溫或接近室溫時為液態(tài)的物質(zhì)，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑和天然產(chǎn)物較單一的相互作用比較，它可與天然產(chǎn)物產(chǎn)生靜電、范德華力、氫鍵等多重相互作用，從而對后者具有較高的溶解度，故被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物提取分離中[10]。超聲輔助離子液體提取結(jié)合了超聲產(chǎn)生的高效空化效應(yīng)和離子液體溶解能力強(qiáng)的特點，是一種高效節(jié)能的綠色提取工藝[11]，故本實驗采用該方法提取續(xù)斷皂苷Ⅵ，并對工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為該成分工業(yè)化生產(chǎn)提供經(jīng)濟(jì)環(huán)保的工藝路線。

1 材料

1.1 試劑與藥物 川續(xù)斷(產(chǎn)地四川涼州)購于四川鹽源縣醫(yī)藥有限責(zé)任公司，經(jīng)金華市食品藥品檢驗檢測研究院蔣士鵬副主任中藥師鑒定為正品。異綠原酸A(DST190918-036，純度>98.0%)、異綠原酸B(DST191008-037，純度>98.0%)、異綠原酸C(DST190904-038，純度>98.0%)、馬錢苷酸(DST191025-033，純度>98.0%)、綠原酸(DST190906，純度>98.0%)、咖啡酸(DST191030-013, 純度>98.0%)、馬錢苷(DST200628-038，純度>98.0%)、川續(xù)斷皂苷乙(DST191202-56，純度>98.0%)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ(DST191126-041，純度>99.0%)對照品均由成都德思特生物技術(shù)有限公司提供。D101大孔樹脂(2019083188)購于安徽三星樹脂科技有限公司。1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([EMIM]BF4，純度≥99%)、1-丙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([PMIM]BF4，純度≥99%)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM]BF4，純度≥99%)、1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽([BMIM]Br，純度≥99%)離子液體均由中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所提供。

1.2 儀器 Agilent 1260 HPLC色譜儀(美國Agilent公司)；LC2030C plus HPLC色譜儀(日本島津公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海耀特儀器設(shè)備有限公司)；電子電平(萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；GT-2227QTS超聲波清洗器(500 W，廣東固特超聲股份有限公司)；真空干燥箱(上海精密儀器儀表公司)。

2 方法

2.1 續(xù)斷皂苷Ⅵ含量測定

2.1.1 色譜條件 填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相乙腈-水(含0.15%三氟乙酸)(29∶71)；柱溫30 ℃；檢測波長215 nm；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按續(xù)斷皂苷Ⅵ計，不低于3 000[12]。

2.1.2 方法學(xué)考察 取續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，20%甲醇制成1 mg/mL溶液，精密移取1、2、3、4、5 mL至10 mL量瓶中，20%甲醇稀釋至刻度，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=189 400X-108.36(r=0.999 8)，在0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。另外，續(xù)斷皂苷Ⅵ平均加樣回收率為98.6%(RSD=0.9%)，精密度RSD為0.4%。

2.2 離子液體種類篩選 取粉碎后過10目篩的藥材10 g，加入離子液體([EMIM]BF4、[PMIM]BF4、[BMIM]BF4、[BMIM]Br)溶液(0.8 mol/L)各100 mL，浸泡2 h后超聲(500 W)處理30 min，離心，加水定容至100 mL，取上清液2 mL，加水稀釋至100 mL，測定續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率。

2.3 單因素試驗

2.3.1 離子液體濃度 配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L離子液體溶液，固定提取功率500 W，料液比1∶10，提取時間30 min，測定續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率。

2.3.2 料液比 固定離子液體種類為[BMIM]BF4，濃度為0.8 mol/L，超聲功率為500 W，提取時間為30 min，選擇料液比1∶3、1∶5、1∶8、1∶10、1∶15，測定續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率。

2.3.3 提取時間 固定離子液體種類為[BMIM]BF4，濃度為0.8 mol/L，超聲功率為500 W，料液比為1∶8，選擇提取時間30、45、60、90、120 min，測定續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率。

2.4 響應(yīng)面法 在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過Design-Expert 11.0.6軟件對離子液體濃度(A，0.6、0.8、1.0 mol/L)、料液比(B，1∶6、1∶8、1∶10)、提取時間(C，30、60、90 min)進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[13]報道。Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-水(含0.05%磷酸)(B)，梯度洗脫(0 min,2%A;0～5 min,2%～6%A;5～18 min,6%～10%A;18～40 min,10%～20%A;40～70 min,20%～25%A;70～80 min,25%～35%A;80～90 min, 35%～50%A;90～110 min,50%～60%A;110～120 min,60%～70%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長212 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.5.2 對照品溶液制備 取異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、馬錢苷酸、綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、川續(xù)斷皂苷乙、續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，20%甲醇制成4 mg/mL溶液，各取1 mL置于20 mL量瓶中，20%甲醇稀釋至刻度，即得(質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL)。

2.5.3 水提、醇提液制備 將藥材粉碎后過10目篩，準(zhǔn)確稱取100 g，分別加入10倍量水、70%乙醇，90 ℃回流提取1 h，重復(fù)3次，合并提取液，取上清液3 mL，加水稀釋至50 mL，即得。

2.6 柱層析分析 將離子液體提取液濃縮，上樣大孔樹脂柱，分別用水和不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫，分段收集洗脫液，測定續(xù)斷皂苷Ⅵ含量，確定柱層析條件。富集續(xù)斷皂苷Ⅵ的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后真空干燥，即得離子液體提取物。

3 結(jié)果

3.1 離子液體種類篩選 圖1顯示，離子液體提取物中含有續(xù)斷皂苷Ⅵ，表明超聲輔助離子液體可對該成分進(jìn)行有效提取。

1.續(xù)斷皂苷Ⅵ

圖2～3顯示，離子液體對續(xù)斷皂苷Ⅵ都有較高的提取率，這是因為它可與該成分進(jìn)行氫鍵、范德華力等多重相互作用；以BF4-為陰離子，咪唑陽離子烷基取代鏈長度從C2增加到C4時，續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率逐漸上升，這是因為隨著離子液體烷基鏈長度增加，它與續(xù)斷皂苷Ⅵ的范德華力加強(qiáng)，可提高提取率；以[BMIM]+為陽離子時，BF4-對續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取效果優(yōu)于Br-，這是因為前者極性大于后者，與含多個羥基該成分的相互作用更強(qiáng)。

圖2 陽離子種類對續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率的影響

圖3 陰離子種類對續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率的影響

3.2 單因素試驗

3.2.1 離子液體濃度 圖4顯示，隨著離子液體濃度升高，續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率先迅速上升后緩慢增長，低濃度下更明顯，其原因可能為離子液體與該成分的范德華力、氫鍵作用促進(jìn)了后者轉(zhuǎn)移，而當(dāng)其濃度達(dá)到一定程度時溶液黏度增加，反而影響了提取效率。綜合考慮成本及提取率，選擇離子液體濃度為0.8 mol/L。

圖4 離子液體濃度對續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率的影響

3.2.2 料液比 圖5顯示，隨著料液比增加，續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率升高，但在1∶8后反而降低，其原因可能為此時該成分基本提取完全，而提取液的增加反而會消耗功率，導(dǎo)致提取量下降。因此，選擇料液比為1∶8。

圖5 料液比對續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率的影響

3.2.3 提取時間 圖6顯示，隨著提取時間延長，續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率升高，但在60 min后程度不明顯。綜合考慮提取效率，選擇提取時間為60 min。

圖6 超聲時間對續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率的影響

3.3 響應(yīng)面法 結(jié)果見表1，二次多項回歸方程為Y=-424.16+494.29A+36.05B+3.19C+5.5AB-0.65AC-0.029 6BC-249.75A2-2.15B2-0.015 4C2，方差分析見表2。

表1 試驗設(shè)計與結(jié)果

表2 方差分析

最終確定，最優(yōu)工藝為離子液體濃度0.905 6 mol/L，料液比1∶9.03，提取時間77.8 min，續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率為100.39%。

3.4 指紋圖譜建立 以續(xù)斷皂苷Ⅵ為對照，測定其他成分相對峰面積，結(jié)果見表3、圖7。由此可知，水提、醇提、離子液體提取對續(xù)斷皂苷乙、咖啡酸的提取率均很低，并且離子液體提取、醇提對續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取效率明顯優(yōu)于水提。

表3 各成分相對峰面積

注：A～D分別為對照品、醇提物、水提物、離子液體提取物。

3.5 柱層析分析 取離子液體提取液100 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(80 ℃，-0.07 MPa)至30 mL左右，上D101大孔樹脂柱，依次用水及10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%乙醇洗脫，洗脫液用量為4倍柱體積，分段收集，每個柱體積收集1瓶，HPLC法測定續(xù)斷皂苷Ⅵ含量，計算累積回收率，結(jié)果見表4。由此可知，水和3個柱體積20%乙醇中不含續(xù)斷皂苷Ⅵ，但可洗脫離子液體和極性較強(qiáng)的雜質(zhì)，而2個柱體積60%乙醇基本可將續(xù)斷皂苷Ⅵ回收完全。

表4 續(xù)斷皂苷Ⅵ累積回收率測定結(jié)果(%)

取水、20%乙醇、60%乙醇洗脫液，在“2.5.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖8。由此可知，水主要洗脫離子液體和極性成分(如馬錢苷酸)，20%乙醇主要洗脫綠原酸、咖啡酸、馬錢苷，60%乙醇主要洗脫續(xù)斷皂苷Ⅵ及異綠原酸A、B、C。

注：A～D分別為對照品、水洗脫液、20%乙醇洗脫液、60%乙醇洗脫液。

3.6 驗證試驗 根據(jù)工藝優(yōu)化、柱層析分析結(jié)果，進(jìn)行3批驗證試驗，每批1 000 g藥材，結(jié)果見表5，可知該工藝穩(wěn)定可靠，重復(fù)性良好。

表5 驗證試驗結(jié)果(n=3)

4 討論與結(jié)論

本實驗采用超聲輔助1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體提取川續(xù)斷活性成分續(xù)斷皂苷Ⅵ，測得提取物收率為12.57%，續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分?jǐn)?shù)79.30%，提取率為99.68%，表明工藝高效可行。離子液體價格昂貴，對其回收利用可大大降低成本，本實驗利用大孔樹脂進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)續(xù)斷皂苷Ⅵ主要集中于60%乙醇洗脫液中，不僅實現(xiàn)了離子液體的分離與回收，同時也使提取物得到了純化。

綜上所述，本實驗利用離子液體與皂苷的多種相互作用力結(jié)合超聲輔助提取技術(shù)，使川續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取能高效完成，并且未使用正丁醇、石油醚等有機(jī)溶劑，減輕了耗能、環(huán)保、安全生產(chǎn)壓力，同時也解決了提取過程中能源、有機(jī)溶劑損耗所帶來的成本過高問題，是一種綠色節(jié)能的提取工藝。