王 妙 任云青 （山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，汾陽032200）

婦科癌癥近年來日益引起人們的關(guān)注，成為一個重要的全球衛(wèi)生保健問題［1］。據(jù)統(tǒng)計，宮頸癌在全世界女性癌癥中的發(fā)病率和死亡率均排第四位［2］，且發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高的態(tài)勢，發(fā)病群體也呈現(xiàn)出年輕化的趨勢。因此，深入研究宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過程中的分子調(diào)控機制，對于指導(dǎo)臨床治療宮頸癌極為重要。

1977 年，SHIU 等［3］發(fā)現(xiàn)在無葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)雞胚成纖維細胞的過程中可誘導(dǎo)產(chǎn)生分子量為78 kD的蛋白，即命名為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucoseregulated protein 78 kD，GRP78），是熱休克蛋白70（Hsp70）家族的成員［4］。有研究證明，GRP78在包括宮頸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中處于高表達［5］，參與腫瘤的增殖、侵襲和遷移，且其表達水平與腫瘤預(yù)后呈負相關(guān)。但關(guān)于GRP78 與宮頸癌之間的作用關(guān)系研究相對較少。因此，本文通過研究GRP78 對宮頸癌SiHa 細胞生物學(xué)行為的影響，初步探討GRP78 在宮頸癌致病過程中的作用機制，為宮頸癌治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌SiHa 細胞由山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院饋贈，本實驗室保存；NC-siRNA及GRP78-siRNA干擾基因購自上海吉瑪；Lipo8000TM及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海碧云天；Transwell 小室（孔徑8 μm）及Matrigel 基質(zhì)膠購自美國 Corning；GRP78 抗體購自ABclonal；E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、Vimentin抗體、AKT 抗體、P-AKTser473抗體、GSK3β 抗體及P-GSK3βser9抗體購自 Proteintech；Cyclin D1 抗體及CDK4抗體購自CST；熒光定量PCR試劑盒購自德國Qiagen；Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒購自北京索萊寶。

1.2 方法

1.2.1 GRP78-siRNA 的轉(zhuǎn)染 將生長狀態(tài)良好的SiHa 細胞制備成3×105個/ml的細胞懸液，實驗分為空白組、NC-siRNA 組、GRP78-siRNA659 組、GRP78-siRNA2082組、GRP78-siRNA1501組，37℃ 培養(yǎng)細胞至匯合度達60%~80%時進行轉(zhuǎn)染。按照實驗所需加入適量 siRNA 和 lipo8000TM，室溫孵育 20 min 后轉(zhuǎn)染。

1.2.2 Western blot 檢測蛋白 取轉(zhuǎn)染48 h 的各組SiHa 細胞，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液裂解細胞，提取蛋白。按BCA 法測蛋白濃度，每孔上樣量30 μg 統(tǒng)一上樣，加入GRP78 抗體（1∶1 000）、E-cadherin（1∶5 000）、N-cadherin（1∶2 000）、Vimentin（1∶1 000）、AKT（1∶500）、P-AKTser47（31∶500）、GSK3β（1∶500）、P-GSK3βser9（1∶500）、Cyclin D1（1∶1 000）、CDK4（1∶1 000）4℃ 孵育過夜，二抗室溫孵育 2 h，TBST 洗膜，凝膠成像儀曝光拍照，使用Image J 軟件分析灰度值。相關(guān)蛋白表達=目的蛋白條帶的灰度值/β-actin蛋白條帶的灰度值。獨立實驗重復(fù)3次。

1.2.3 qRT-PCR 檢測GRP78 mRNA 轉(zhuǎn)染36 h后，PBS 洗滌兩次，將細胞沉淀收集至EP 管。RNA提取參照TRIzol 試劑說明書進行操作，通過測定A260和A280，分析RNA 濃度及純度，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板進行PCR 擴增，PCR 擴增條件：95℃ 預(yù)變性2 min；95℃ 5 s；60℃ 10 s，共 40 個循環(huán)。以 β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行統(tǒng)計分析。每次實驗設(shè)3 個復(fù)孔，獨立實驗重復(fù)3 次。擴增用引物序列見表1。

表1 擴增引物的序列Tab.1 Sequence of amplified primers

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 轉(zhuǎn)染48 h 后，胰酶消化離心，PBS 洗滌后用Binding Buffer 重懸細胞，向管中加5 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。再加 5 μl PI，室溫避光孵育 5 min。1 h 內(nèi)流式細胞儀上機檢測。獨立實驗重復(fù)3次。

1.2.5 劃痕實驗 取對數(shù)生長期SiHa 細胞，按3×105個/孔細胞數(shù)量接種至6孔板，待細胞密度達60%~80%時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化離心，DMEM完全培養(yǎng)基重懸，再按每孔3×105個細胞加到6孔板中。待其貼壁且呈單層融合時，棄去培養(yǎng)基，用100 μl 無菌槍頭劃線，PBS 洗去脫落的細胞，再換上新鮮的無血清DMEM，分別于0 h、12 h、24 h、48 h 對著固定部位的劃痕區(qū)域拍照，比較各時間點細胞的遷移率。細胞遷移率（%）=（劃痕0 h 的劃痕面積-其余各時間點的劃痕面積）/劃痕0 h 的劃痕面積×100%，獨立實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell侵襲實驗 50 μl Matrigel膠按1∶5用無血清DMEM 稀釋，每孔70 μl 將其均勻加在Transwell 小室中，37℃ 溫育2~4 h，使其呈凝膠狀態(tài)。用無血清DMEM 將細胞調(diào)至2×105個/ml，上室加 200 μl 細胞懸液，下室加 600 μl 完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)18 h。細胞侵襲完成后，用濕棉簽小心擦去小室內(nèi)底部表面的細胞，4%多聚甲醛室溫固定30 min，再用甲醇通透細胞20 min，0.1%結(jié)晶紫室溫避光染色20 min，顯微鏡下隨機選取5 個視野拍照計數(shù)、統(tǒng)計結(jié)果。每組設(shè)3個復(fù)孔，獨立實驗重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell 遷移實驗 與Transwell 侵襲實驗的區(qū)別在于Transwell 小室不用包被Matrigel 膠，其余操作步驟同Transwell 侵襲實驗，獨立實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 軟件（Version 5）進行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果用表示，兩組間的均數(shù)比較行單因素方差分析及獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染不同位點siRNA對GRP78表達的影響 與空白組和NC-siRNA 組相比，轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA各組 SiHa 細胞中 GRP78 蛋白及 GRP78 mRNA 表達明顯降低且GRP78-siRNA1501 的沉默效果最明顯，表明轉(zhuǎn)染成功，見圖1。此后，將沉默效率最高的GRP78-siRNA1501用于后續(xù)實驗。

圖1 不同位點siRNA 轉(zhuǎn)染后SiHa 細胞GRP78 蛋白和GRP78 mRNA的表達水平Fig.1 Expression levels of GRP78 protein and GRP78 mRNA in SiHa cells after siRNA transfection at dif?ferent sites

2.2 轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA1501后對SiHa細胞凋亡率的影響 Annexin V-FITC/PI 雙染結(jié)果顯示，與NC-siRNA 組 SiHa 細胞凋亡率相比，GRP78-siRNA1501組的SiHa 細胞凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖2。

圖2 流式細胞術(shù)檢測各組SiHa細胞凋亡率Fig.2 Flow cytometry to detect apoptosis rate of SiHa cells in each group

2.3 轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA1501 后對SiHa 細胞侵襲、遷移行為的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，與空白組和NC-siRNA組相比，各檢測時間點GRP78-siRNA1501組的SiHa 細胞遷移率均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A。Transwell（孔徑 8.0 μm）結(jié)果證明，GRP78-siRNA1501 組的SiHa 細胞穿過小室膜的數(shù)量明顯低于空白組和NC-siRNA組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），表明轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA1501后SiHa 細胞的侵襲和遷移能力均明顯降低，見圖3B、表2。

圖3 轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA1501對SiHa細胞侵襲和遷移能力的影響Fig.3 Effects of transfection of GRP78-siRNA1501 on invasion and migration of SiHa cells

表2 轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA1501后對SiHa細胞侵襲和遷移能力的影響（）Tab.2 Effects of transfection of GRP78-siRNA1501 on in?vasion and migration of SiHa cells（）

表2 轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA1501后對SiHa細胞侵襲和遷移能力的影響（）Tab.2 Effects of transfection of GRP78-siRNA1501 on in?vasion and migration of SiHa cells（）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.001.

Number of invasion cells 209.0±5.15 202.8±5.45 93.0±4.441）17.07 0.000 Groups Blank NC-siRNA GRP78-siRNA1501 t P Number of migration cells 234.0±8.86 222.0±9.70 95.6±5.991）12.94 0.000

2.4 轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA1501后對SiHa細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的影響 與空白組和NC-siRNA組相比，GRP78-siRNA1501組SiHa細胞中E-cadherin表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），而 N-cadherin 和 Vimentin 的表達水平顯著低于空白組和NC-siRNA 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA1501后對SiHa細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig.4 Influence of GRP78-siRNA1501 transfection on ex?pression level of epithelial-mesenchymal transition associated proteins in SiHa cells

2.5 轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA1501 后對SiHa 細胞增殖相關(guān)蛋白的影響 與空白組和NC-siRNA 組相比 ，GRP78-siRNA1501 組 SiHa 細 胞 中 P-AKTser473、P-GSK3βser9、Cyclin D1、CDK4 的表達水平明顯下降，而各組SiHa細胞中總AKT、總GSK3β的表達水平無明顯變化，GRP78-siRNA1501 組中的SiHa 細胞PAKTser473/AKT 和 P-GSK3βser9/GSK3β 的比值均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。以上數(shù)據(jù)表明，沉默GRP78 可以抑制SiHa 細胞的增殖能力，推測 GRP78 可能通過 AKT/GSK3β/Cyclin D1 信號通路促進SiHa細胞的增殖，見圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA1501后對SiHa細胞增殖相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig.5 Influence of GRP78-siRNA1501 transfection on ex?pression level of proliferation-related proteins in Si?Ha cells

3 討論

宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，也是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因。因此，尋找致病過程中的相關(guān)分子，對阻止疾病的發(fā)展和疾病治療十分必要。GRP78 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的常駐蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時會出現(xiàn)高表達，在多種腫瘤中也處于高表達，調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生、增殖、侵襲和遷移相關(guān)的信號通路，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)移擴散［6］。

秦娟等［7］發(fā)現(xiàn)，GRP78在宮頸癌組織中高表達，且GRP78 mRNA 在低分化鱗癌中的相對表達水平明顯高于高分化鱗癌，GRP78 蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本。為進一步闡明GRP78 在宮頸癌發(fā)展過程中的作用，本課題通過沉默GRP78 基因研究其對宮頸癌SiHa細胞生物學(xué)行為的影響。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。EMT 的激活導(dǎo)致細胞極性的喪失、細胞與細胞連接的破壞、基底膜的降解以及細胞外基質(zhì)的重組［8］。ZHANG 等［9］在其結(jié)腸癌的研究中表明，高表達的GRP78 通過調(diào)控 N-cadherin、Vimentin 和 E-cadherin等EMT 關(guān)鍵標(biāo)志物的表達，最終誘發(fā)腫瘤細胞發(fā)生EMT。為了探究其對宮頸癌SiHa 細胞侵襲和遷移能力的影響，本課題采用RNA干擾技術(shù)沉默SiHa細胞中GRP78 基因的表達，通過劃痕實驗和Transwell實驗進行檢測。結(jié)果顯示，沉默GRP78基因可使Si-Ha 細胞的侵襲和遷移能力明顯被抑制。而且沉默SiHa 細胞 GRP78 基因后，SiHa 細胞中 E-cadherin 表達水平增高，N-cadherin 和Vimentin 表達水平降低，提示沉默GRP78 可能通過逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制SiHa 細胞的侵襲和遷移。據(jù)此證實，GRP78 可以促進SiHa細胞的侵襲和遷移能力。

AKT 信號通路是通過磷酸化而活化的，活化狀態(tài)的AKT 可以調(diào)節(jié)許多與細胞代謝、凋亡、增殖和分化相關(guān)的蛋白質(zhì)，從而抑制細胞凋亡，促進癌細胞的生長［10］。AKT 的激活可以促進下游分子GSK3β 的磷酸化，從而發(fā)揮保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默 GRP78 基因后，各組 SiHa 細胞總 AKT、總GSK3β 的表達水平無明顯變化，而GRP78-siRNA1501 組 SiHa 細胞中 P-AKTser473、P-GSK3βser9的表達明顯降低。以上結(jié)果說明，在總AKT 及總GSK3β相當(dāng)?shù)那闆r下，GRP78-siRNA1501 組SiHa 細胞中的P-AKTser473和 P-GSK3βser9明顯降低，P-AKTser473/AKT和 P-GSK3βser9/GSK3β 明顯降低，提示沉默 GRP78基因可以抑制AKT 的激活。Cyclin D1 作為Cyclins家族的重要成員之一，結(jié)合并激活G1期中的調(diào)控因子CDK4，形成Cyclin D1/CDK4 復(fù)合物進而磷酸化激活相應(yīng)底物促使細胞由 G1 期進入 S 期［11］。Cyclin D1 在大部分人類腫瘤中處于過表達［12］。過表達的Cyclin D1導(dǎo)致CDK 活性異常，在有絲分裂信號受限的條件下細胞快速生長，繞過細胞關(guān)鍵檢查點，最終導(dǎo)致腫瘤生長［13］。Cyclin D1、CDK4 作為細胞周期的正性調(diào)控因子，其在宮頸癌中又是如何發(fā)揮作用的？本實驗證實，沉默GRP78 基因后，Cyclin D1和CDK4 表達水平也明顯降低，低表達的Cyclin D1和CDK4 減慢了細胞周期由G1 期進入S 期，從而縮短了SiHa細胞的生長周期，減慢了SiHa細胞的增殖速度。以上數(shù)據(jù)表明，沉默GRP78基因可以抑制Si-Ha 細胞的增殖，推測其可能通過抑制AKT/GSK3β/Cyclin D1信號通路抑制SiHa細胞的增殖。

細胞凋亡是指細胞程序性的死亡過程［14］。促進細胞凋亡也是治療腫瘤的重要途徑之一。沉默GRP78 是否會促進SiHa 細胞的凋亡，本研究用Annexin V-FITC/PI 進行雙染，流式細胞術(shù)檢測SiHa 細胞凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC-siRNA 組相比，GRP78-siRNA1501 組的SiHa 細胞凋亡率明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，這與之前的研究報道一致［5］。說明沉默GRP78基因也可以促進SiHa細胞凋亡。

綜上所述，沉默GRP78基因可以抑制SiHa細胞增殖、侵襲和遷移并且促進其凋亡。增殖能力減弱可能與抑制AKT/GSK3β/Cyclin D1 信號通路有關(guān)，侵襲和遷移能力減弱可能與抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的進程有關(guān)。本課題的研究成果說明GRP78 基因與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可以為臨床治療宮頸癌提供科學(xué)的理論依據(jù)。