王 智 李 靜 王繼光 高 倩 魏 琰 （衡水市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，衡水053000）

視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）為脊髓和視神經(jīng)相繼或同時損傷的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，疾病早期多表現(xiàn)為視神經(jīng)脫髓鞘等病變，患者多伴隨視力變差、意識障礙、眼球顫動等，嚴(yán)重可導(dǎo)致失明，若受損神經(jīng)持續(xù)缺血變性可進展為多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS），威脅患者生命［1-2］。糖皮質(zhì)激素具有免疫抑制和抵抗炎癥等功能，為臨床治療NMO等自身免疫性疾病的首選藥物，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，高劑量糖皮質(zhì)激素沖擊療法可有效改善NMO患者臨床癥狀，但作用機制尚未闡明［3-4］。既往研究認為，NMO與機體免疫失調(diào)相關(guān)，但免疫失調(diào)如何導(dǎo)致神經(jīng)病變尚未明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）可結(jié)合其受體（S1P receptor，S1PR），激活的S1P-S1PR 信號系統(tǒng)在淋巴細胞轉(zhuǎn)運和維持血管完整性方面發(fā)揮重要作用，從而參與復(fù)雜炎癥過程調(diào)節(jié)［5］。另有研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞（astrocytes，AST）表面 S1PR1、S1PR3 與 S1P 結(jié)合是其激活的關(guān)鍵，而 NMO 發(fā)病與 AST 細胞激活密切相關(guān)［6-7］。本研究推測S1PR1、S1PR3 可能是NMO 所致視神經(jīng)脫髓鞘的治療靶標(biāo)，通過建立NMO視神經(jīng)脫髓鞘大鼠模型，觀察糖皮質(zhì)激素對NMO大鼠視神經(jīng)脫髓鞘及視覺功能的改善作用，并分析其對視神經(jīng)組織S1PR1、S1PR3 蛋白表達的影響，以初步探究其治療NMO的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6 周齡雄性健康SD 大鼠45 只，體重（220±5）g，許可證號：SCXK（粵）2018-0002，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，常規(guī)飼養(yǎng)于我院動物房，實驗設(shè)計經(jīng)我院動物倫理委員會批準(zhǔn)，遵守動物保護3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（40 mg/支）購自常州四藥制藥有限公司；S1PR1、S1PR3、β-actin、鈣結(jié)合適配器分子1（Iba-1）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、POU 4級同源框1（POU4F1，又稱Brn3a）、巨噬細胞標(biāo)記物ED-1 兔源抗體（貨號：ab77076、ab108370、ab8227、ab178847、ab4674、ab273099、ab31630）、驢抗兔IgG Alexa Fluor?647 抗體（貨號：ab150075）、羊抗兔IgG Alexa Fluor?488 抗體、DAPI 溶液（貨號：ab150077、ab104139）購自美國Abcam 公司；Tunel細胞凋亡綠色熒光試劑盒（貨號：C1088）購自上海碧云天有限公司；透射電子顯微鏡（型號：109T）購自美國Carl Zeiss Microscopy 公司；熒光顯微鏡（型號：BX50）、光學(xué)顯微鏡（型號：BX63）購自日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組 參照文獻［8-9］并稍加改動，采用視神經(jīng)鞘內(nèi)注射人NMO-IgG（1 μl，20 mg/μl）法制備NMO大鼠，即為視神經(jīng)脫髓鞘大鼠，術(shù)后14 d瞳孔收縮度明顯降低表明模型制備成功。造模過程中3 只大鼠未觀察到瞳孔收縮度明顯改變，共造模成功42 只，隨機分為：NMO 組、糖皮質(zhì)激素組，每組14 只，另取14 只健康大鼠作為對照組。造模成功后14 d，糖皮質(zhì)激素組大鼠尾靜脈輸注0.5 g/ml甲潑尼龍溶液（生理鹽水溶解），0.1 m/lmin，60 min，1 次/d，對照組、NMO 組輸注等量生理鹽水，連續(xù)給藥3 d。

1.2.2 視動實驗及瞳孔反射實驗評估大鼠視覺功能 末次給藥后12 h，隨機取10 只大鼠，參考WANG 等［10］方法進行視動實驗，將大鼠放在四面各有1臺顯示器的平臺上，黑暗環(huán)境中進行測試，顯示器上顯示垂直正弦波光柵（100%對比度），空間頻率依次為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 周/度（cpd），恒定速度為12 度/s。紅外敏感相機監(jiān)測頭部運動圖像，大鼠頭部無明顯跟蹤運動時的最高空間頻率即為大鼠視銳度值。瞳孔反射實驗參考FERNANDEZ 等［11］方法，將大鼠置于黑暗中，采用高強度光刺激瞳孔30 s，紅外敏感相機采集眼睛瞳孔圖像（30幀/s），瞳孔收縮度（%）=（刺激前瞳孔直徑-刺激后瞳孔直徑）/刺激前瞳孔直徑×100%。

1.2.3 大鼠視網(wǎng)膜及視神經(jīng)組織樣本采集及HE染色觀察 1.2.2 結(jié)束后，100 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死大鼠，各組隨機取11 只，于眼科顯微鏡下取眼球（保留較長視神經(jīng)），分離視網(wǎng)膜和視神經(jīng)，含4%甲醛的PBS固定，制備石蠟切片（5 μm），部分切片采用HE 試劑盒染色，選取較完整切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜及視神經(jīng)，剩余切片用于Tunel、免疫熒光及免疫組化實驗；-80℃保存?zhèn)溆玫囊暽窠?jīng)用于提取RNA 和蛋白。各組剩余3 只大鼠取眼球（保留較長視神經(jīng)）后，分離視神經(jīng)，含2%戊二醛和4%甲醛的PBS 中固定，制備超薄切片（70 nm）用于電鏡觀察。

1.2.4 透射電鏡檢測大鼠視神經(jīng)脫髓鞘情況 取1.2.3 中超薄切片，70%乙醇溶液（含2%乙酸鈾酯）和檸檬酸鉛溶液染色，銅網(wǎng)固定，透射電鏡下觀察。

1.2.5 Tunel 法檢測視網(wǎng)膜RGC 細胞凋亡情況 取1.2.3中視網(wǎng)膜石蠟切片，按照Tunel試劑盒說明書依次處理切片，采用Brn3a 標(biāo)記凋亡視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cell，RGC），DAPI 復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察，計算凋亡RGC 細胞比例。其中Brn3a 陽性（紅色熒光）為RGC 細胞；Tunel 陽性（綠色）為凋亡細胞；DAPI 陽性（藍色）為細胞核，Merge中呈黃色為凋亡RGC 細胞，每組10 片視網(wǎng)膜，每片視網(wǎng)膜取5個視野計算平均值。

1.2.6 免疫熒光法觀察視神經(jīng)中巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和AST 細胞 取1.2.3 中視神經(jīng)石蠟切片，脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)抗原，固定，含0.1%Triton X-100 PBS 溶液通透，2%山羊血清封閉，分別加入 Iba-1、GFAP 及 ED1 一抗 4℃ 孵育過夜，洗片，加入熒光標(biāo)記二抗室溫避光孵育50 min，洗片，加入DAPI室溫避光孵育5 min，含抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下拍照并用ImagePro Plus 分析熒光強度，ED1 陽性（綠色熒光）為巨噬細胞；Iba1 陽性（紅色）為小膠質(zhì)細胞；GFAP 陽性（紅色）為AST 細胞，每組10根視神經(jīng)，每根取5個視野計算平均值。

1.2.7 免疫組化法檢測視神經(jīng)中S1PR1、S1PR3、IL-17 表達 取1.2.3 中視神經(jīng)石蠟切片，脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)抗原，過氧化氫封閉，加入S1PR1、S1PR3及IL-17一抗室溫孵育1.5 h，洗片，加入HRP 標(biāo)記二抗室溫避光孵育30 min，洗片，加入DAB 混合液室溫避光孵育5 min，蘇木精復(fù)染，光學(xué)顯微鏡拍照。

1.2.8 RT-qPCR 和Western blot 法檢測視神經(jīng)中S1PR1、S1PR3 mRNA 和蛋白表達 取 1.2.3 中視神經(jīng)冷凍樣品，液氮研磨，提取RNA 和蛋白。RNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后作為RT-qPCR 反應(yīng)模板，以β-actin 作為內(nèi)參進行RT-qPCR 擴增反應(yīng)，檢測S1PR1、S1PR3 mRNA 表達，引物序列見表1。各組蛋白樣品采用BCA 法測定濃度，分別取15 g 上樣，依次進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)印記、5%牛奶封閉，加入一抗 S1PR1、S1PR3 和 β-actin 抗體 4℃ 孵育過夜，加入二抗室溫孵育1.5 h，增強化學(xué)發(fā)光液顯影，TANON成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS25.00 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖皮質(zhì)激素對NMO大鼠視覺功能的影響 與對照組相比，NMO 組及糖皮質(zhì)激素組大鼠視銳度、瞳孔收縮度降低（P＜0.05）；與NMO 組相比，糖皮質(zhì)激素組大鼠視銳度、瞳孔收縮度增高（P＜0.05，表2）。

表2 3組大鼠視銳度、瞳孔收縮度比較（，n=10）Tab.2 Comparison of visual acuity and pupil contraction of rats in three groups（，n=10）

表2 3組大鼠視銳度、瞳孔收縮度比較（，n=10）Tab.2 Comparison of visual acuity and pupil contraction of rats in three groups（，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs Control；2）P＜0.05 vs NMO.

Pupil contraction（%）78.09±3.61 36.21±3.341）69.43±4.231）2）Groups Control NMO Glucocorticoid Visual acuity（cpd）0.57±0.06 0.17±0.051）0.34±0.021）2）

2.2 糖皮質(zhì)激素對NMO大鼠視神經(jīng)組織的影響 對照組大鼠視神經(jīng)結(jié)構(gòu)正常，軸索纖維及神經(jīng)元均勻著色，排列整齊；NMO 組大鼠視神經(jīng)可見神經(jīng)元體積變大、排列混亂、核染色較深，軸索纖維中呈空泡及炎癥細胞浸潤病變；糖皮質(zhì)激素組上述病變明顯緩解，形態(tài)接近對照組（圖1）。

圖1 大鼠視神經(jīng)組織HE染色（×400）Fig.1 HE staining of optic nerve tissue in rats（×400）

2.3 糖皮質(zhì)激素對NMO大鼠視神經(jīng)脫髓鞘程度的影響 對照組大鼠視神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)正常，均可見黑色髓鞘；NMO 組大鼠大部分視神經(jīng)可見軸突退化、脫髓鞘、板層小體等病變；糖皮質(zhì)激素組脫髓鞘程度明顯減輕，形態(tài)接近對照組（圖2）。

圖2 大鼠視神經(jīng)組織透射電鏡圖（×100 000）Fig.2 Transmission electron microscope of optic nerve tis?sue in rats（×100 000）

2.4 糖皮質(zhì)激素對NMO大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)及細胞凋亡的影響 對照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常，凋亡RGC細胞較少；相較于對照組，NMO 組、糖皮質(zhì)激素組大鼠視網(wǎng)膜厚度降低，RGC 細胞數(shù)減少，凋亡RGC 細胞比例增高（P＜0.05）；相較于NMO 組，糖皮質(zhì)激素組視網(wǎng)膜厚度升高，RGC 細胞數(shù)增多，凋亡RGC 細胞比例降低（P＜0.05，圖3、表3）。

表3 大鼠視網(wǎng)膜厚度、RGC細胞數(shù)及凋亡RGC細胞比例比較（，n=10）Tab.3 Comparison of retinal thickness，number of RGC cells and proportion of apoptotic RGC cells of rats（，n=10）

表3 大鼠視網(wǎng)膜厚度、RGC細胞數(shù)及凋亡RGC細胞比例比較（，n=10）Tab.3 Comparison of retinal thickness，number of RGC cells and proportion of apoptotic RGC cells of rats（，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs Control；2）P＜0.05 vs NMO.

Proportion of apoptotic RGC cells（%）3.05±0.95 37.50±3.341）19.35±1.961）2）Groups Control NMO Glucocorticoid Retinal thickness（μm）263.11±7.51 159.23±6.951）196.67±8.021）2）RGC cells number（individual）91.05±6.15 45.75±4.331）71.15±4.921）2）

圖3 大鼠視網(wǎng)膜HE染色及Tunel檢測（×400）Fig.3 HE staining and Tunel examination of rat retina（×400）

2.5 糖皮質(zhì)激素對NMO 大鼠視神經(jīng)巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和AST 細胞的影響 相較于對照組，NMO組、糖皮質(zhì)激素組大鼠視神經(jīng)巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和AST 細胞增多（P＜0.05）；相較于NMO 組，糖皮質(zhì)激素組視神經(jīng)巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和AST 細胞減少（P＜0.05，圖4、表4）。

表4 3 組大鼠視神經(jīng)中巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和AST 細胞比例比較（，n=10）Tab.4 Comparison of proportions of macrophages，mi?croglia and AST cells in optic nerve of rats in three groups（，n=10）

表4 3 組大鼠視神經(jīng)中巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和AST 細胞比例比較（，n=10）Tab.4 Comparison of proportions of macrophages，mi?croglia and AST cells in optic nerve of rats in three groups（，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs Control；2）P＜0.05 vs NMO.

Groups Control NMO Glucocorticoid ED1+region 0.00±0.00 12 752.42±296.481）Iba1+region 3 091.05±126.15 10 745.75±144.321）GFAP+region 9 823.05±150.72 19 643.50±183.391）5 194.67±108.021）2）5 671.15±114.811）2）11 079.35±1.751）2）

圖4 大鼠視神經(jīng)組織免疫熒光圖（×400）Fig.4 Immunofluorescence of rat optic nerve tissue（×400）

2.6 糖皮質(zhì)激素對NMO 大鼠視神經(jīng)中S1PR1、S1PR3、IL-17表達的影響 相較于對照組，NMO 組、糖皮質(zhì)激素組大鼠視神經(jīng)中S1PR1、S1PR3、IL-17表達增多（P＜0.05）；相較于NMO 組，糖皮質(zhì)激素組視神經(jīng)中 S1PR1、S1PR3、IL-17 表達減少（P＜0.05，圖5）。

圖5 大鼠視神經(jīng)組織免疫組化圖（×400）Fig.5 Immunohistochemistry of optic nerve tissue in rats（×400）

2.7 糖皮質(zhì)激素對NMO 大鼠視神經(jīng)中S1PR1、S1PR3 mRNA 及蛋白表達的影響 相較于對照組，NMO 組、糖皮質(zhì)激素組大鼠視神經(jīng)中S1PR1、S1PR3 mRNA 及蛋白表達增多（P＜0.05）；相較于NMO 組，糖皮質(zhì)激素組視神經(jīng)中S1PR1、S1PR3 mRNA及蛋白表達減少（P＜0.05，圖6、表5）。

表5 3 組大鼠視神經(jīng)中S1PR1、S1PR3 mRNA 及蛋白表達比較（，n=10）Tab.5 Comparison of mRNA and protein expression levels of S1PR1，S1PR3 in optic nerve of rats in three groups（，n=10）

表5 3 組大鼠視神經(jīng)中S1PR1、S1PR3 mRNA 及蛋白表達比較（，n=10）Tab.5 Comparison of mRNA and protein expression levels of S1PR1，S1PR3 in optic nerve of rats in three groups（，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs Control；2）P＜0.05 vs NMO.

Groups protein 0.35±0.11 1.46±0.281）1.01±0.161）2）S1PR1 mRNA 1.05±0.23 5.97±0.771）3.01±0.541）2）Control NMO Glucocorticoid protein 0.55±0.16 3.08±0.421）1.21±0.331）2）S1PR3 mRNA 0.96±0.34 4.71±0.591）2.78±0.371）2）

圖6 Western blot檢測大鼠視神經(jīng)中S1PR1、S1PR3表達Fig.6 Western blot of S1PR1 and S1PR3 expressions in optic nerve of rats

3 討論

多數(shù)NMO 患者均檢測到血清自身抗體NMO 免疫球蛋白G（NMO-IgG）存在，為揭示NMO 發(fā)病機制提供了方向。由于NMO-IgG 與NMO 的相關(guān)性，NMO-IgG 被動轉(zhuǎn)移已被用于建立NMO 嚙齒動物模型［12-13］。大鼠視神經(jīng)鞘內(nèi)注射人NMO-IgG 建立的NMO 模型可直接反映視神經(jīng)病變對視覺功能的影響，有利于評估藥物對視神經(jīng)病變的治療作用［8-9］。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，NMO 組大鼠視銳度、瞳孔收縮度降低，視神經(jīng)現(xiàn)脫髓鞘、神經(jīng)元體積變大、排列混亂、軸突退化、巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和AST細胞增多等病變，視網(wǎng)膜厚度及RGC 細胞數(shù)減少，凋亡RGC 細胞比例增高，表明視神經(jīng)注射NMO-IgG可成功誘導(dǎo)NMO 病變，引起視神經(jīng)脫髓鞘、小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞活化、膠質(zhì)增生、視覺功能變差，提示模型制備成功。隨著對NMO 發(fā)病機制研究的深入，對其治療藥物的研發(fā)也逐漸增多，對現(xiàn)有藥物治療機制的挖掘可能為尋找新藥物提供思路。臨床研究發(fā)現(xiàn)，高劑量（500 mg/d）糖皮質(zhì)激素可加速急性期 MS 或 NMO 患者康復(fù)，減輕視神經(jīng)炎癥［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，輸注糖皮質(zhì)激素后，大鼠視銳度、瞳孔收縮度均增高，視神經(jīng)脫髓鞘、神經(jīng)元體積變大、巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和AST 細胞增多等病變減輕，視網(wǎng)膜厚度及RGC細胞數(shù)增加，凋亡RGC細胞比例降低，表明糖皮質(zhì)激素可減輕視神經(jīng)脫髓鞘程度，抑制小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞活化及膠質(zhì)增生，改善NMO大鼠視覺功能。

S1P-S1PR 信號系統(tǒng)可啟動AST 細胞活化，與神經(jīng)組織中炎癥密切相關(guān)，其中S1PR1、S1PR3 為S1PR 家族中與MS 等自身免疫病相關(guān)的2 種受體，除可通過激活A(yù)ST 細胞活化、誘導(dǎo)膠質(zhì)增生外，還可促進神經(jīng)細胞中小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞活化，誘導(dǎo)IL-17 等炎癥介質(zhì)釋放，加速神經(jīng)損傷［15］。研究發(fā)現(xiàn)，S1P-S1PR 信號系統(tǒng)可引起腦組織等中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)性膠質(zhì)增生，促進炎癥反應(yīng)，與MS 等疾病相關(guān)［16-17］。研究報道，MS 與 AST 細胞 S1PR3 高表達有關(guān)，細胞實驗亦發(fā)現(xiàn)，上調(diào)S1PR3，激活S1P-S1PR信號系統(tǒng)可促進AST 細胞激活、膠質(zhì)增生及炎癥反應(yīng)［18-19］。由于 NMO 和 MS 具有廣泛相似的癥狀，且均為免疫介導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病，可能具有潛在分子機制，本研究對此進行初步探究，結(jié)果與MS 一致，相較于對照組，NMO 組及糖皮質(zhì)激素組大鼠視神經(jīng)中 S1PR1、S1PR3 及 IL-17 蛋白表達均增高，表明NMO 所致視神經(jīng)脫髓鞘大鼠視神經(jīng)組織中S1P-S1PR 系統(tǒng)被激活，且下游IL-17 等炎癥因子水平升高。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可通過降低S1P 水平抑制S1P 與S1PR 結(jié)合，降低炎癥水平，改善MS 小鼠神經(jīng)功能缺失，減輕脫髓鞘等病變［20-21］。TSAI 等［22］進一步證實，S1PR1 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫和神經(jīng)炎癥中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，給予糖皮質(zhì)激素治療后，大鼠視神經(jīng)中 S1PR1、S1PR3 及 IL-17 蛋白表達降低，推測糖皮質(zhì)激素對NMO所致視神經(jīng)脫髓鞘大鼠視覺功能的改善作用可能與抑制S1PR1、S1PR3 表達，降低視神經(jīng)炎癥水平有關(guān)，S1PR1、S1PR3 表達降低可阻斷S1P-S1PR 信號系統(tǒng)，進而抑制視神經(jīng)中AST 細胞及小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞激活，減輕視神經(jīng)炎癥，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，高劑量糖皮質(zhì)激素可降低視神經(jīng)中S1PR1、S1PR3 蛋白表達，抑制 IL-17 等釋放，降低視神經(jīng)中炎癥細胞比例，改善NMO所致視神經(jīng)脫髓鞘大鼠視覺功能，可能為尋找治療NMO的新藥物提供參考。另外，高劑量糖皮質(zhì)激素可能引起心動過速、代謝紊亂、電解質(zhì)失調(diào)等副作用，治療時應(yīng)密切關(guān)注患者生命體征，以確保治療效果。