龔一帆 唐冰花 宋新貌 湯荔 王朱健 曹文俊

（1.復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院檢驗科 上海 200031；2.復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院放療科 上海 200031）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是源于鼻咽部上皮組織的一種頭頸部惡性腫瘤，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，預后較差。全世界約80%的NPC 患者在中國，早期診斷、早期治療是提高NPC患者生存率及降低死亡率的重要手段。然而NPC早期癥狀隱匿，容易被誤診、漏診[1]。大量研究表明，EB 病毒感染及其導致的一系列表觀遺傳學改變與NPC 發(fā)病有著密切關(guān)系[2-3]，聯(lián)合多項EB 病毒抗體檢測對NPC 的診斷有臨床意義[4-6]；然而各方報道在項目組合及結(jié)果解讀上仍存在爭議，并缺少大樣本、多中心的臨床研究。本研究通過酶聯(lián)免疫 吸 附 測 定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測662 例初診NPC 患者和731 例健康成人血清中EB 病毒的免疫球蛋白A（immunoglobulin A,IgA）抗體，包括Z 反式激活因子（Z trans activator,Zta）/IgA、EB 病毒核抗原1（EB virus nuclear antigen 1,EBNA1）/IgA、衣殼抗原（viral capsid antigen,VCA）/IgA，總結(jié)并分析EB 病毒IgA 不同結(jié)果模式對NPC診斷的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 資料 NPC 組：2016～2019 年在我院就診、經(jīng)鼻咽活檢病理確診、未經(jīng)治療的NPC 患者662 例，年齡12～88 歲，平均53.34 歲，中位年齡為55 歲；男性471 例、女性191 例。健康對照組：同期健康體檢人群731 例，其中男性475 例、女性256 例；年齡18～76 歲，平均44.27 歲，中位年齡為43 歲。臨床篩查組：同期因有NPC 癥狀，來我院就診排除NPC 的患者157 例，男性96 例、女性61 例；年齡12～86 歲，平均48.46 歲，中位年齡為47 歲。3組患者的性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究遵循《赫爾辛基宣言》的原則。本研究的設(shè)計和實施經(jīng)我院倫理委員會批準，所有研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 方法 采集患者靜脈血4 mL 于真空管中，30 min 凝固后以3 000 轉(zhuǎn)/min 離心10 min，之后分離血清標本檢測。Zta/IgA、EBNA1/IgA 抗體檢測試劑盒購自中山生物有限公司，VCA/IgA 抗體檢測試劑盒購自歐蒙（德國）醫(yī)學實驗診斷股份有限公司。均采用ELISA 檢測，根據(jù)試劑說明書進行操作。酶標儀型號為Tecan（瑞士）貿(mào)易有限公司Sunrise 酶標儀?？贵w水平以標本吸光度（optical density，OD）值/ Cutoff 值計算相對吸光度值表示。相對吸光度值大于診斷界值時定為陽性，低于或等于診斷界值時為陰性。

1.3 統(tǒng)計學處理 本研究應(yīng)用GraphPad Prism 5 繪制受試者操作特征（receptor operation characteristic，ROC）曲線，MedCalc14 及軟件進行t檢驗及卡方檢驗，以ROC 曲線計算出最佳診斷界值，并計算各抗體的敏感度、特異度、約登指數(shù)及曲線下面積（area under the curve,AUC）。

2 結(jié)果

NPC 患者血清中Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 3種抗體的水平分別為3.344±3.422、3.674±2.746、5.676±3.889，健康人群中3 種抗體的水平分別為0.165±0.395、0.318±0.627、0.709±0.835，NPC 患者EB 病毒抗體水平均顯著高于健康對照組（P值均＜0.001）。3 種抗體的ROC 曲線見圖1。3 種抗體根據(jù)ROC 曲線計算出的最佳臨界值，靈敏度、特異度、約登指數(shù)、AUC 及陽性預測值比較見表1。

圖1 NPC患者3種抗體ROC曲線 A.Zta/IgA；B.VCA/IgA；C.NA1/IgA。

表1 NPC患者3種抗體的最佳臨界值、靈敏度、特異度、約登指數(shù)及AUC比較

EB 病 毒Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 3 種抗體組合的8 種不同結(jié)果模式在健康對照組、NPC組及臨床篩查組中出現(xiàn)的比例見表2?？梢钥闯觯篘PC 組出現(xiàn)單獨1 種抗體陽性結(jié)果模式的比例顯著低于健康對照組，而2 種或3 種抗體陽性的結(jié)果比例顯著高于健康對照組，3 種抗體全陽的結(jié)果模式在NPC 組中出現(xiàn)的概率最高，可達74.77%，而健康對照組則只有6 例，全陽的結(jié)果模式有著最高的陽性預測值率，達98.82%。臨床篩查組中，除單獨Zta/IgA、EBNA1/IgA 及Zta/IgA+EBNA1/IgA 陽性的 結(jié)果模式，其他模式比例均高于健康對照組。

表2 各抗體結(jié)果模式在健康對照組、NPC組及臨床篩查組中出現(xiàn)的比例[n（%）]

157 例臨床篩查組的Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 陽性率分別為24.84%，29.93%和40.76%，顯著高于健康對照組，低于NPC 組（P＜0.0001），其中有42 例患者進行了病理活檢，最終確診17 例。42 例抗體結(jié)果為全陰的患者有12 例，無NPC 病理結(jié)果；單抗體陽性13 例，有4 例病理確診NPC；9例雙抗體陽性的患者中，有5 例病理診斷NPC；8 例 3 種抗體全陽的患者最終均經(jīng)病理確診為NPC。

3 討論

有文獻[7]報道，NPC 經(jīng)放射化學治療（簡稱放化療）后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的5 年無復發(fā)生存率分別為95.7%、64.7%、54.5%、41.1%，認為早期診斷及對高危人群的跟蹤隨訪是提高NPC 治愈率,獲得良好預后的關(guān)鍵。作為診斷金標準的病理檢查往往由于受病程、病變部位及采樣因素的影響，而無法早期確診。在世界衛(wèi)生組織（WHO）的NPC 專著中，有研究[8]認為組合應(yīng)用ELISA 血清學可輔助診斷NPC，并在國內(nèi)得到證實。然而，90%以上的世界人口存在EBV 的潛伏感染[9]，造成EB 病毒抗體血清檢查在NPC 的篩查中存在相當比例的假陽性及假陰性，進而引起臨床醫(yī)師及患者的疑慮[10]。因此，如何選擇高靈敏度及特異度的抗體組合并對結(jié)果進行準確分析及判斷，幫助臨床更準確地評估疾病風險成為目前急需解決的問題。

EB 病毒感染宿主后，多數(shù)細胞中的DNA 病毒處于潛伏狀態(tài)，并合成EBNA1，部分病毒可進入溶解感染期，最終宿主細胞裂解，病毒顆粒釋放，細胞合成溶解早期蛋白Zta、溶解晚期合成VCA 等相關(guān)蛋白[11-12]，這些抗原與免疫系統(tǒng)反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)抗體。由于IgA抗體與IgG相比具有更短的血清半衰期，因此我們分析不同人群中EB 病毒Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 3 種抗體的結(jié)果模式來研究3 種抗體聯(lián)合檢測對于NPC 診斷的臨床意義。結(jié)果顯示，3種抗體均具有較好的特異度、靈敏度、約登指數(shù)、AUC 及陽性預測值，與國內(nèi)采用相同方法學的研究結(jié)果一致[13-15]。我們通過大樣本研究進一步證實了3 種抗體對于NPC 具有較高的診斷效能，認為3 種抗體與NPC 患者EB 病毒各感染期活躍的免疫應(yīng)答密切相關(guān)，是NPC 血清學診斷的可靠指標。

3 種抗體聯(lián)合檢測的各種結(jié)果模式在NPC 組及健康對照組中出現(xiàn)的比例均存在顯著差異（P值均＜0.05）。所有的單抗體陽性模式在健康對照組中出現(xiàn)的比例較NPC 組高，而2 種或3 種抗體陽性的結(jié)果模式則更多出現(xiàn)在NPC 組中，提示EB 病毒感染在NPC 患者中存在著與正常人群截然不同的免疫反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，662 例NPC 患者中3 種抗體全陽的結(jié)果模式占74.77%，而731 例健康對照人群中僅有6 例，陽性預測值可達98.82%，即3 種抗體陽性的樣本中98.82%為確診NPC 患者。結(jié)果表2 中雙抗體陽性的陽性預測值為64.29%～84.78%，單抗體陽性結(jié)果模式的陽性預測值較低，為10.81%～24.66%，而3 種抗體全陰的患病風險僅為1.42%。在臨床篩查組中也有相同的表現(xiàn)，抗體陽性數(shù)越多，病理確診率越高，證實聯(lián)合檢測3 種EB 病毒IgA 抗體，可以有效提高疾病診斷的準確性，與單獨抗體檢測相比具有更高的特異度、靈敏度及陽性預測值，通過結(jié)果模式的分析可以幫助臨床進行風險分級，對高危人群進行跟蹤隨訪，有助于疾病的早期診斷。

由于我們的研究只檢測EB 病毒相關(guān)抗體，因此檢測結(jié)果容易受到個體免疫因素或EB 病毒免疫逃避機制的影響。此外，一些病理類型的NPC 與EB 病毒關(guān)系不密切[16]，也影響了抗體檢測對診斷的靈敏度。在抗體全陰性的6 例NPC 患者中有2 例病理分型為中低分化型鱗癌，1 例在治療后隨訪出現(xiàn)抗體陽性。這是由于大部分情況下抗體早于病變出現(xiàn)，但是免疫逃避使得抗體出現(xiàn)滯后于病變，因此需要進一步研究與其他腫瘤相關(guān)標志物的聯(lián)合檢測來提高診斷的準確性。

EB 病毒Zta/IgA、EBNA1/IgA、VCA/IgA 3 種抗體聯(lián)合檢測方法簡便、經(jīng)濟，相對于EB 病毒DNA檢測更易于推廣，可進行大樣本的篩查，并幫助臨床更好地評估疾病風險，有助于NPC 的早期診斷。