楊敏，滾雙寶,2，閆尊強，王鵬飛，楊巧麗，黃曉宇，唐于然，石海霞，馬艷萍，趙進

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬技術(shù)工程研究中心，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學圖書館，甘肅 蘭州 730070；4.甘肅省靈臺縣什字鎮(zhèn)畜牧開發(fā)服務站，甘肅 平?jīng)?744404)

microRNA(miRNA)是一類長約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼的單鏈RNA分子，主要通過與靶mRNA的3′UTR區(qū)特異性結(jié)合降解靶基因mRNA或抑制其正常翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平以序列特異性的方式調(diào)控靶基因的表達[1]，能夠在眾多生理、病理過程中發(fā)揮重要功能[2].

諸多學者對miRNA在豬病毒性、細菌性腸道疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用開展了大量研究.吳俊靜等[3]研究報道，miR-27b-3p能顯著抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV)在宿主細胞中的增殖；Yao等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-143和miR-26在沙門氏菌感染豬的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用；訾臣[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-192和miR-7136-5p能通過調(diào)控其相應的靶基因在斷奶仔豬對大腸桿菌侵襲、維持腸道穩(wěn)定、免疫調(diào)控等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用.以上研究表明，miRNA在豬病毒性和細菌性腸疾病發(fā)生的過程中發(fā)揮著重要的作用.產(chǎn)氣莢膜梭菌，又稱魏氏桿菌，能夠引起動物腹瀉、腸毒血癥等腸道疾病[6-7].Dinh等[8]和Hong等[9]研究證明，肉仔雞在感染產(chǎn)氣莢膜梭菌后，其小腸中miRNA表達發(fā)生了明顯變化.Hong等[10]研究報道，被灌服產(chǎn)氣莢膜梭菌后的羅斯雞出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象；郭宇[11]和王玉建等[12]研究發(fā)現(xiàn)，羔羊在感染產(chǎn)氣莢膜梭菌后出現(xiàn)腹瀉并呈現(xiàn)出典型的小腸潰瘍現(xiàn)象.這些研究表明，miRNA在雞、羊等動物感染產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的腹瀉等疾病中起著重要作用.根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生致病性毒素的不同，將其分為A、B、C、D和E 5種類型[13]，其中，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起仔豬腹瀉的重要病原菌之一[14].Petit等[15]研究發(fā)現(xiàn)，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌侵入機體后，粘附到小腸上皮細胞的絨毛頂端，并能夠在絨毛基底膜處大量繁殖，其產(chǎn)生的毒素直接或間接作用于腸絨毛和內(nèi)皮細胞，導致上皮細胞損傷和壞死，引起絨毛粘膜或組織出血、壞死，進而導致仔豬腹瀉.

目前，有關(guān)miR-96-5p的研究多集中在癌癥和腫瘤方面，已有研究表明，miR-96-5p可以通過靶向作用于轉(zhuǎn)移抑制蛋白1(metastasis suppressor 1，MTSS1)、窩蛋白-l(caveolae-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteinyl aspartate-specific protease-9，caspase-9)等基因參與結(jié)腸癌、卵巢癌、肝癌、甲狀腺癌、膀胱癌、腎上腺皮質(zhì)和腎上腺髓質(zhì)腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[16-20].本課題組前期對感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌仔豬的回腸組織進行了Illumina Solexa高通量測序，發(fā)現(xiàn)差異表達miRNA共有53個，對測序數(shù)據(jù)進行深入分析，發(fā)現(xiàn)差異表達的miR-96-5p很可能在仔豬抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染過程中起重要調(diào)控作用[21]，但是miR-96-5p在仔豬各組織中的表達情況以及其通過哪些靶基因及通路發(fā)揮功能尚不清楚，還有待開展相關(guān)研究.本研究擬采用RT-qPCR檢測miR-96-5p在仔豬不同組織中的表達量，從而構(gòu)建組織表達譜，利用生物信息學方法預測其靶基因并進行GO功能和KEGG通路富集分析，篩選和鑒定miR-96-5p靶向調(diào)控C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的關(guān)鍵靶基因，以期進一步加深miR-96-5p在調(diào)控仔豬抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染過程中的具體分子機制研究，為培育抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉豬品系提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物選用體質(zhì)量和初生重基本相同且大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌抗體均為陰性的健康仔豬30頭，從中隨機挑選5頭作對照組(IC)，其余25頭攻毒，攻毒組仔豬每頭每天灌服C型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2標準菌株培養(yǎng)液1 mL，而對照組仔豬則灌服等量不含菌液的培養(yǎng)液，試驗期5 d[22].參考腹瀉評分標準對各仔豬腹瀉進行評分[23]，根據(jù)腹瀉總評分將攻毒組仔豬由高到低進行排序，前五名及后五名分別分為易感組(IS)和耐受組(IR).試驗期滿后屠宰仔豬，采集心、肝、脾、肺、腎、十二指腸、空腸、回腸等組織，液氮速凍保存，帶回實驗室后-80 ℃超低溫冰箱保存.

1.2 試驗試劑

Trizol試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司(北京，中國)；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime SeriptTMreagent Kit with gDNA Eraser、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒miRNA First Strand Synthesis Kit試劑盒、熒光定量試劑盒TB Greenser with gDNTaqTMaqGr(Tli RNaseH Plus)均購自寶生物工程有限公司(大連，中國).

1.3 總RNA提取及cDNA合成

參照Trizol使用說明書，用Trizol法提取仔豬各組織總RNA，使用超微量紫外分光光度計測定其濃度和純度，再用凝膠電泳檢測其完整性，合格后的總RNA于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.4 引物的設計與合成

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中選取試驗驗證所需的基因及內(nèi)參基因GAPDH的mRNA序列，采用Primer Premier 5.0和Primer-BLAST軟件設計引物.在miRBase數(shù)據(jù)庫上查找豬miR-96-5p的成熟體序列(UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU)，設計上游引物(GGCACTAGCACATTTTTGCT)，下游使用試劑盒自帶通用引物，以U6為內(nèi)參.引物由金唯智生物科技有限公司(蘇州)合成，引物詳細信息見表1.

表1 引物信息

1.5 miR-96-5p在不同物種中的保守性分析

在miRBase數(shù)據(jù)庫(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中下載人(Homosapiens)、大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)、豬(Susscrofa)、大西洋鱈(Gadusmorhua)、鴨嘴獸(Ornithorhynchusanatinus)、安大略鮭(Salmosalar)、錦龜(Chrysemyspicta)、家兔(Oryctolaguscuniculus)、斑馬魚(Daniorerio)、九帶犰狳(Dasypusnovemcinctus)、原鴿(Columbalivia)、中央狐蝠(Pteropusalecto)、豚鼠(Caviaporcellus)等14個物種miR-96-5p的成熟序列，采用MEGA 5.0軟件分析其保守性.

1.6 miR-96-5p靶基因預測及功能分析

由于目前關(guān)于miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫中尚無豬這一種屬，因此將miR-96-5p按照序列比對至人的miRNA，再通過TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、miRDB(http://www.mirdb.org/)3種數(shù)據(jù)庫預測miR-96-5p靶基因，利用Venny在線軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取3種數(shù)據(jù)庫的交集；然后結(jié)合miRTarBase(http://miRtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/browse.php)數(shù)據(jù)庫中已驗證的miR-96-5p靶基因，共同組成miR-96-5p的靶基因集合.利用DAVID Bioinformatics Resources 6.7中的Functional Annotation Tool對miR-96-5p的預測靶基因進行Gene Ontology(GO)和KEGG-Pathway通路富集分析.

1.7 RT-qPCR檢測

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-96-5p的保守性分析

在miRBase數(shù)據(jù)庫中檢索出人、大鼠、小鼠、豬、大西洋鱈、鴨嘴獸、安大略鮭、錦龜、家兔、斑馬魚、九帶犰狳、原鴿、中央狐蝠、豚鼠14個物種miR-96-5p的成熟序列，進行對比分析(表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-96-5p的成熟體序列為：UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU，在各個物種(如人、大鼠、家兔)之間具有高度的保守性.

表2 多個物種(miR-96-5p)成熟體序列

2.2 miR-96-5p的組織表達譜構(gòu)建

本研究對對照組仔豬各組織中的miR-96-5p進行了定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-96-5p在空腸中的表達量最高，其次為肺、回腸組織，在肝、腎、十二指腸和胃中度表達，心臟和脾臟中表達量較低(圖1).

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).

2.3 miR-96-5p靶基因預測

選擇TargetScan、miRWalk和miRDB 3款生物信息學軟件預測miR-96-5p的靶基因，分別得到418、1 101和10 189個靶基因，3款軟件交集的共有179個基因(圖2)，合并miRTarBase數(shù)據(jù)庫中已知的21個靶基因，去掉7個重復，將最終獲得的193個靶基因作為后續(xù)GO功能和KEGG通路富集分析的靶基因集合.

圖2 miR-96-5p靶基因交集預測

2.4 miR-96-5p靶基因GO功能和KEGG通路富集分析

2.4.1 miR-96-5p靶基因GO功能分析 對獲得的193個靶基因集合進行GO功能條目注釋分類和富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2)，在生物學過程(biological process，BP)層面，miR-96-5p靶基因主要顯著富集在肌動蛋白細胞骨架組織、大腦皮層發(fā)育、經(jīng)典Wnt信號通路的負調(diào)控、平滑肌組織發(fā)育、通路受限的SMAD蛋白磷酸化的負調(diào)控、神經(jīng)元干細胞群維持、蛋白酶體泛素依賴蛋白分解代謝過程的正調(diào)控、神經(jīng)元凋亡過程的正調(diào)控GO功能條目中(P<0.01)；在細胞組分(cellular component，CC)層面，靶基因顯著富集于樹突、神經(jīng)元胞體GO條目中(P<0.01)；在分子功能(molecular function，MF)層面，靶基因顯著富集于金屬離子結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合GO條目中(P<0.01).

2.4.2 miR-96-5p靶基因KEGG通路富集分析 對預測所得靶基因集合中的193個基因進行信號通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖3)，在KEGG數(shù)據(jù)庫中，miR-96-5p預測的靶基因集合顯著富于ErbB、MAPK、FoxO、PI3K-Akt、癌癥中的通路等12個信號通路和前列腺癌、膠質(zhì)瘤、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、子宮內(nèi)膜癌等8個與疾病相關(guān)的通路.其中與免疫炎癥反應和感染性疾病相關(guān)的ErbB、MAPK信號通路也發(fā)生了顯著富集(P<0.05).

圖3 miR-96-5p靶基因KEGG通路富集分析

表3 miR-96-5p的靶基因統(tǒng)計

表4 miR-96-5p靶基因GO富集分析

2.5 RT-qPCR分析結(jié)果

miR-96-5p的RT-qPCR結(jié)果與高通量測序結(jié)果基本一致(圖4-A～B).對miR-96-5p的2個關(guān)鍵的靶基因(FOXO1、MAP2K1)的表達量進行了RT-qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)靶基因FOXO1和MAP2K1的表達量與miR-96-5p成相反趨勢，并且兩個靶基因的表達趨勢均表現(xiàn)為，IR和IS組極顯著低于IC組(P<0.01)，IS組極顯著低于IR組(P<0.01，圖4-C～D).

IC：對照組；IR：耐受組；IS：易感組；**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05).

3 討論

miRNA在生物體內(nèi)具有重要的調(diào)控功能，涉及到生物體生命活動的各個方面，包括生長發(fā)育、器官形成、細胞分化及凋亡和多種疾病(如腹瀉)的發(fā)生發(fā)展[24].Zheng等[25]研究發(fā)現(xiàn)，miR-221-5p在預防和治療豬流行性腹瀉病毒的感染的過程中起重要作用.Yao等[26]研究發(fā)現(xiàn)，miR-221、miR-125b和miR-27b在豬抵抗沙門氏菌感染導致腹瀉過程中起重要作用.孫倩[27]研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可以起刺激MAPK和PIK3-Akt等信號通路的作用，進而影響腸道免疫因子，影響仔豬腸道的健康.腹瀉在養(yǎng)豬生產(chǎn)中普遍存在，是導致仔豬死亡的主要原因[28]，嚴重影響了養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益.仔豬腹瀉與飼養(yǎng)管理、病原菌感染、遺傳等因素密切相關(guān)[29]，病原菌感染引起仔豬腹瀉在生產(chǎn)中常見，其中C型產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起仔豬腹瀉的病原菌之一[14,30]，其主要寄生并侵襲仔豬腸道，從而引起腹瀉[31].本課題組前期對感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌仔豬回腸組織進行了高通量測序，篩選出差異表達miR-96-5p，推測其可能在仔豬感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉的過程中發(fā)揮著重要的作用[21].

諸多研究表明，miRNA的表達具有組織特異性[27]，這種特異性表達與其發(fā)揮的特異性功能密切相關(guān)[31]，Liang等[33]和Chan等[34]研究發(fā)現(xiàn)，miR-183、miR-135和miR-150等能夠在豬脂肪組織中特異性表達，具有促進脂肪沉積的作用；吳正常等[35]研究發(fā)現(xiàn)，miR-215和miR-192可以在豬腸道部分特異性表達，能夠參與維持斷奶仔豬腸道正常功能，并在心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、胸腺和淋巴等組織器官中呈中低表達.王偉等[31]研究發(fā)現(xiàn)，miR-204在豬與免疫炎癥相關(guān)的組織器官中特異性表達，發(fā)揮著與免疫相關(guān)的作用，miR-204還在腎臟組織及小腸各段組織中呈中高度表達.本研究通過構(gòu)建miR-96-5p的組織表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-96-5p在豬空腸、回腸等腸道組織高表達，十二指腸部分中度表達(圖1)，這說明miR-96-5p在腸道部分具有組織表達特異性，推測其在維持仔豬腸道正常功能方面具有重要作用.

本課題組前期對感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌仔豬回腸組織進行了高通量測序，篩選出了差異表達miR-96-5p[21]，推測其可能是仔豬抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的重要miRNA分子.本研究預測了miR-96-5p的靶基因集合并對其進行了KEGG富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-96-5p的靶基因顯著富集于一些與腹瀉、腸道炎癥等疾病相關(guān)的信號通路，如ErbB信號通路和MAPK信號通路.Yan等[36]和Yang等[37]的研究也發(fā)現(xiàn)，MAPK通路在小鼠腸道炎癥的治療、改善腸道疾病以及維護腸粘膜屏障的完整性方面起著重要的作用；Zhang等[38]研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌源真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌醇通過激活MAPK信號通路誘導豬小腸上皮細胞產(chǎn)生炎癥因子；Duan等[39]研究發(fā)現(xiàn)，通過腸上皮中的鉀通道和氯通道激活ErbB通路可抑制腹瀉.由此我們推測，顯著富集的ErbB和MAPK信號通路上的基因在仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉中有重要調(diào)控作用.經(jīng)初步篩選，得到2個顯著富集的ErbB和MAPK信號通路上miR-96-5p的靶基因FOXO1和MAP2K1，已有報道指出FOXO1基因是一種著名的腫瘤抑制基因，可以調(diào)控DNA的修復和細胞周期的轉(zhuǎn)變[40]，馬莉莉[41]在研究牛病毒性腹瀉病毒過程中，將牛病毒性腹瀉病毒感染的胎牛腎細胞，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)FOXO1基因差異表達，說明FOXO1在病毒性腹瀉病毒感染的疾病中起作用；Yang等[42]在炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的研究中發(fā)現(xiàn)，高表達的miR-425靶向調(diào)控FOXO1促進淋巴細胞生成大量的炎性因子Th17，說明FOXO1的下調(diào)表達會促進炎性因子的生成，這與本試驗中仔豬在感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌后，相比較于IC組仔豬，IR組與IS組仔豬回腸的表達量明顯下調(diào)結(jié)果一致.MAP2K1基因，又稱Mek1，是蛋白激酶家族的成員之一[43].曹燕飛[44]研究發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)實驗大鼠結(jié)腸粘膜組織MAP2K1基因的表達，發(fā)現(xiàn)對潰瘍性結(jié)腸炎起到了治療作用，說明MAP2K1基因起到了抑制炎癥作用；宋金楊[45]在研究中發(fā)現(xiàn)，MAP2K1是miR-181a的靶基因，miR-181靶向調(diào)控MAP2K1的表達進而調(diào)節(jié)下游NLRP3炎癥通路激活，說明MAP2K1基因下調(diào)表達可起到促進炎癥作用，而上調(diào)表達時則會抑制炎癥，這與本試驗中仔豬在感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌后，MAP2K1基因在IC組、IR組和IS組表達量依次降低的結(jié)果相符合.因此，推測這些關(guān)鍵靶基因(FOXO1和MAP2K1)可能在仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉的過程中起著重要的作用.

4 結(jié)論

仔豬回腸組織中高表達的miR-96-5p可能通過調(diào)控ErbB、MAPK信號通路中的關(guān)鍵靶基因MAP2K1和FOXO1來參與仔豬抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的腹瀉過程，起抑制仔豬腸道組織中的炎癥反應的作用，該研究結(jié)果可為深入研究C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導致仔豬腹瀉的分子機理提供參考.