安宇夢，李先婷，王培正， 張嬋

(河南師范大學生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

植物的生長發(fā)育過程受到多種環(huán)境因素的影響，植物的繁殖階段對外界環(huán)境變化尤為敏感[1].低溫脅迫、暴雨頻發(fā)是青藏高原及周邊高山地區(qū)的典型氣候特征[2]，惡劣的生境條件對植物的繁殖過程產(chǎn)生極大影響.低溫不僅限制高山生態(tài)系統(tǒng)中傳粉昆蟲的活動能力，還影響受精后植物的胚胎發(fā)育過程，并最終影響果實和種子的發(fā)育和成熟[3]；雨水則直接沖刷花粉并降低花粉萌發(fā)率[4].因此，在青藏高原極端惡劣的生境條件下，高山植物進化出一系列適應性策略以保障繁殖成功，表現(xiàn)出對環(huán)境高度特化的響應[2].菊科的水母雪兔子(Saussureamedusa)和綿頭雪兔子(Saussurealaniceps)等棉毛植物的苞片上密布毛狀體，濃密絨毛具有吸熱和保溫作用的同時也可以防止雨水對繁殖器官造成傷害[4-5].蓼科的塔黃(Rheumnobile)和菊科的氈毛雪蓮(Saussureavelutina)等溫室植物花序外圍半透明的苞片可以起到保溫作用，有助于植物胚胎的早期發(fā)育，提高種子的產(chǎn)量[6-7].另外，一些植物在不同生活史階段采取相應的進化策略來適應外部環(huán)境變化，例如茄科植物賽莨菪(Anisodusluridus)在花期時花梗向下彎曲，有效防止了雨水對花粉的沖刷；在果期時花梗直立，則可以使宿存花萼貯水；由于水具有維持溫度穩(wěn)定的作用，花萼貯水能夠有效促進果實發(fā)育，提高種子數(shù)量和萌發(fā)率[8].

花冠閉合現(xiàn)象是高山植物應對低溫多雨環(huán)境的又一獨特適應機制[9].花冠閉合現(xiàn)象分為暫時性花冠閉合和永久性花冠閉合兩類.暫時性花冠閉合現(xiàn)象是指在夜晚或暴風雨來臨前或者周圍環(huán)境溫度驟降時，植物花冠迅速閉合，當天氣好轉(zhuǎn)或溫度回升后再重新開放的現(xiàn)象，具有可逆性；而永久性花冠閉合現(xiàn)象是指植物花冠在完成授粉后永久閉合不再開放的現(xiàn)象[5，10].兩種花冠閉合現(xiàn)象在龍膽科植物中均較為常見[11]，是龍膽科植物對低溫多雨高山環(huán)境的一種適應性策略，但花冠閉合現(xiàn)象對植物雌雄繁殖適合度的影響及其適應性意義的相關研究卻少有報道.本文以龍膽科一年生草本植物喉毛花(Comastomapulmonarium)為研究對象，測量花冠開放和閉合過程中的環(huán)境溫度變化，觀測人工授粉對花冠開合狀態(tài)的影響，并比較人為制止兩種花冠閉合現(xiàn)象后其雌雄繁殖適合度的變化情況，旨在探討喉毛花兩種花冠閉合現(xiàn)象的誘導機制，暫時性花冠閉合現(xiàn)象和永久性花冠閉合現(xiàn)象對喉毛花雌雄繁殖適合度的影響，以及喉毛花的花冠閉合現(xiàn)象對高山極端環(huán)境適應性的意義.

1 材料與方法

1.1 研究地點

本研究于2016年7～8月在中國科學院海北高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)定位觀測站(下文簡稱海北站)(N 37°29′～37°45′,E 101°12′～101°23′)開展.海北站地處青藏高原東隅，祁連山北支冷龍嶺東段南麓的大通河河谷西段，海拔3 200～3 600 m.屬于典型的高原大陸性氣候，年平均氣溫-1.7 ℃，年極端最高氣溫27.6 ℃，極端最低氣溫-37.1 ℃，年內(nèi)沒有絕對無霜期.年平均降水量426～860 mm，且主要集中在5～9月.典型植被類型為以金露梅(Potentillafruticosa)為建群種的高寒灌叢草甸和以嵩草屬(Kobresia)植物為建群種的高寒嵩草草甸[12].

1.2 研究材料

喉毛花，龍膽科喉毛花屬一年生草本，分布在海拔3 000～4 800 m的高山地區(qū)，高5～30 cm.淡藍色花單生莖頂或枝頂，主花軸通常產(chǎn)生數(shù)個側(cè)枝.喉毛花的花冠呈管狀，裂片基部有一圈白色毛狀副冠.雄蕊5，著生于花冠筒上.果實為蒴果，種子小，微外露.海北站地區(qū)的喉毛花主要通過自交產(chǎn)生種子，并且存在嚴重的近交衰退現(xiàn)象[13].

1.3 研究方法

1.3.1 兩種花冠閉合現(xiàn)象的誘導機制

1.3.1.1 暫時性花冠閉合現(xiàn)象 在清晨花冠開放和傍晚花冠閉合過程中，隨機標記20朵喉毛花頂花，每5 min記錄一次花冠直徑并用手持式溫濕度記錄儀(OM-EL-USB-2-LCD,OMEGA,USA)測量花冠近旁氣溫，直至20朵頂花完全開放或完全閉合.

1.3.1.2 永久性花冠閉合現(xiàn)象 隨機標記40個植株，平均分為2組，在花蕾期對頂花進行去雄，其中1組待柱頭張開后人工授異花花粉，另外1組不授粉維持自然狀態(tài)，分別記錄兩組植株頂花的單花壽命.

1.3.2 兩種花冠閉合現(xiàn)象對喉毛花繁殖適合度的影響

1.3.2.1 發(fā)育胚珠數(shù)量、受精率 隨機選取并標記60個植株的頂花花蕾，平均分為3組，一組待其頂花開放后，用透明膠布粘貼固定其花瓣使之無法正常閉合，該處理目的為制止暫時性和永久性花冠閉合現(xiàn)象(T1)；第二組待其頂花自然授粉完成且花冠永久閉合后，將花瓣撥開并用透明膠布固定以制止永久性花冠閉合現(xiàn)象(T2)；最后一組不作任何處理作為對照(CK).由于喉毛花的敗育種子在果實成熟時會消失而難以統(tǒng)計結籽率，但是其未受精的胚珠和受精胚珠可以清晰區(qū)分，因此該研究采用受精率代替結籽率.待開花兩周后，取上述3組喉毛花的頂花，用解剖刀剖開其子房，在體式顯微鏡下分別統(tǒng)計各子房內(nèi)發(fā)育胚珠和未發(fā)育胚珠的數(shù)量，并計算受精率.

受精率=發(fā)育胚珠數(shù)/總胚珠數(shù)

1.3.2.2 種子數(shù)及百粒質(zhì)量 重復1.3.2.1中的3組處理，待各株的頂花果實發(fā)育成熟后，采集分裝在紙袋內(nèi)帶回實驗室統(tǒng)計種子數(shù)量.將各組種子自然干燥一個月后，用萬分之一電子天平分別稱量其百粒質(zhì)量，重復20次.

1.3.2.3 種子萌發(fā)率 將1.3.2.2中稱量結束后的種子置于-20 ℃冰箱內(nèi)進行一個月的春化處理，隨后在24 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)進行萌發(fā).將3組種子分別放置于表面被濕潤濾紙包裹、直徑為6 cm的小培養(yǎng)皿上，每組重復3次.將每組的3個小培養(yǎng)皿放入直徑為15 cm、裝有少量蒸餾水的大培養(yǎng)皿中.每日兩次統(tǒng)計每個小培養(yǎng)皿上萌發(fā)的種子數(shù)量(當胚根長度大于0.5 mm時即視為萌發(fā))，注意將發(fā)霉種子移出培養(yǎng)皿并記錄數(shù)量，同時適時補充蒸發(fā)掉的水分以保持濾紙濕潤.記錄持續(xù)進行到連續(xù)5 d沒有新的種子萌發(fā)為止，最后計算每個小培養(yǎng)皿上的種子萌發(fā)率.

種子萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)量/總種子數(shù)量

1.3.2.4 剩余花粉數(shù)量 重復1.3.2.1中的3組處理.由于喉毛花的雄蕊先熟，單花花期為4～5 d，散粉期為2～3 d，在各植株頂花開始散粉后注意觀察，若標記植株的頂花在其花期第2天18∶00前經(jīng)歷1 h以上的較強降雨(即花藥經(jīng)歷了雨水沖刷)，則用鑷子摘取全部5枚雄蕊，統(tǒng)計花粉數(shù)量以檢驗兩種花冠閉合現(xiàn)象在削弱雨水對花粉沖刷過程中的作用.若標記植株未經(jīng)歷雨水沖刷，則重新標記新的頂花花蕾并重復1.3.2.1中的3組處理方法，直至所有用于統(tǒng)計剩余花粉數(shù)量的頂花在開始散粉后均已經(jīng)歷降雨過程.將各處理中所取的雄蕊分別置于1 mL FAA固定液(福爾馬林∶乙酸∶95%乙醇體積比 5∶5∶90)中，依據(jù)Dafni[14]的方法，加入少量混合試劑(50%乙醇加入適量洗滌劑充分混勻)定容至2 mL，充分震蕩搖勻，使剩余花粉粒均勻分散在溶液中，用微量移液器吸取5 μL置于載玻片上，在光學顯微鏡下統(tǒng)計每滴溶液中的花粉數(shù)量，重復計數(shù)10次，按比例計算每朵花的剩余花粉數(shù)量.

1.3.2.5 花粉萌發(fā)率 選取50個正在散粉的喉毛花頂花，每朵隨機摘取1枚正在散粉的新鮮花藥，平均分為兩組，將其中一組25枚花藥分別置于裝有10%蔗糖溶液(常用于花粉體外萌發(fā)，接近于自然狀態(tài)下的花粉萌發(fā)環(huán)境[15])的離心管中；另外一組25枚花藥分別置于裝有蒸餾水的離心管中.兩組花粉各自萌發(fā)8 h后，在100倍光學顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，以檢測雨水浸泡對花粉萌發(fā)率的影響，當花粉管長度大于花粉直徑即視為萌發(fā)，最后計算花粉萌發(fā)率.

花粉萌發(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)量/總花粉數(shù)量

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS16.0 for Windows軟件進行平均值和標準誤的計算，用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD Post-hoc比較制止暫時性花冠閉合、制止永久性花冠閉合以及對照3組數(shù)據(jù)之間的差異性；用獨立樣本t檢驗比較人工授粉與否對喉毛花單花壽命的影響，以及喉毛花在蔗糖溶液和蒸餾水中花粉萌發(fā)率之間的差異性.

2 結果與分析

2.1 兩種花冠閉合現(xiàn)象的誘導機制

在花冠開放和花冠閉合過程中，喉毛花的花冠直徑與近旁氣溫呈顯著正相關關系(P<0.01,圖1)，說明喉毛花暫時性花冠閉合現(xiàn)象受低溫誘導.人工授粉處理組的單花壽命顯著低于自然狀態(tài)下的未授粉組(t=6.846,P<0.01,表1)，說明授粉因素誘導喉毛花發(fā)生永久性花冠閉合.

表1 授粉對單花壽命的影響

圖1 花冠直徑與近旁溫度的回歸關系

2.2 兩種花冠閉合現(xiàn)象對繁殖適合度的影響

制止暫時性和永久性花冠閉合現(xiàn)象的T1處理組中受精率(P<0.01)、種子數(shù)量(P<0.01)、種子百粒質(zhì)量(P<0.01)、種子萌發(fā)率(P<0.01)和剩余花粉數(shù)量(P<0.01)均較對照(CK)顯著降低，而發(fā)育胚珠數(shù)在兩組間無顯著差異(P=0.221,表2).

制止永久性花冠閉合現(xiàn)象的T2處理組與對照(CK)相比，種子百粒質(zhì)量(P<0.01)和種子萌發(fā)率(P<0.01)顯著降低，而發(fā)育胚珠數(shù)(P=0.867)、受精率(P=0.581)、種子數(shù)量(P=0.492)和剩余花粉數(shù)量(P=0.446)與對照組均無顯著差異(表2).另外，T1處理組中受精率(P<0.01)、種子數(shù)量(P<0.01)和剩余花粉數(shù)量(P<0.01)均顯著低于T2處理組(表2).

表2 花冠閉合現(xiàn)象對繁殖適合度的影響

在蒸餾水中浸泡萌發(fā)8 h后的花粉萌發(fā)率顯著低于在接近自然萌發(fā)環(huán)境的10%蔗糖溶液中浸泡萌發(fā)相同時間的花粉萌發(fā)率(t=30.67,P<0.01)(表 3).

表3 水浸泡對花粉萌發(fā)率的影響

3 討論

喉毛花的暫時性花冠閉合現(xiàn)象除影響剩余花粉數(shù)量及其雄性繁殖適合度，同時也通過影響種子數(shù)量影響其雌性繁殖適合度.制止暫時性花冠閉合現(xiàn)象后，喉毛花的剩余花粉數(shù)量減少，受精率降低，并最終引起種子數(shù)量減少.首先，由于缺少閉合花冠的保護作用，雨水會沖刷掉花藥和柱頭上落下的花粉，造成花粉的損失[8].另外，雨水的長時間浸泡會使花粉粒吸水脹破失去活性，從而降低花粉質(zhì)量[9，16-17].

本研究中喉毛花的花粉在蒸餾水中浸泡后，其萌發(fā)率顯著低于浸泡在接近花粉萌發(fā)環(huán)境的10%的蔗糖溶液，這表明雨水浸泡影響花粉質(zhì)量.雨水對花粉數(shù)量和質(zhì)量的影響不僅會降低植物的雄性繁殖適合度，還會進一步造成胚珠受精率的降低以及種子數(shù)量的減少，從而影響雌性繁殖適合度[18].前人也有研究證實了暫時性花冠閉合現(xiàn)象對龍膽科高山龍膽(Gentianaalgida)和麻花艽(Gentianastraminea)雌雄繁殖適合度的影響[9，19].青藏高原地區(qū)降雨集中發(fā)生于7月和8月，而此時正值喉毛花的盛花期，暴雨來臨前往往伴隨著周圍環(huán)境溫度的驟降，因此，這種低溫誘導的暫時性花冠閉合現(xiàn)象是喉毛花對該地區(qū)夏季頻發(fā)暴雨的一種適應機制，能夠有效保護雌雄配子免受雨水的損害，提高喉毛花的雌雄繁殖適合度.

授粉因素誘導喉毛花發(fā)生永久性花冠閉合，人工授粉后單花壽命顯著縮短.以往的研究也表明，柱頭接受花粉后，植物的花壽命會顯著縮短[20-21].一種解釋是授粉后花壽命縮短受花粉提供者主導，花粉到達柱頭后就會排斥后來花粉，從而獨占受精的機會，授粉后植物組織內(nèi)產(chǎn)生乙烯，誘導花的萎蔫，縮短花壽命，從而在與其他花粉的父權競爭中取得優(yōu)勢[22-25]；另一種解釋是授粉誘導的永久性花冠閉合降低了蒸騰作用引起的水分損失[26]以及花的呼吸作用[27]和花蜜生產(chǎn)[28]等資源消耗，這對于在高山極端生境下減少維持花冠開放的資源消耗具有重要意義.永久性花冠閉合現(xiàn)象對喉毛花的雌性繁殖適合度具有重要影響，制止永久性花冠閉合現(xiàn)象后，喉毛花的種子百粒質(zhì)量和萌發(fā)率顯著降低.首先，永久性花冠閉合保護子房避免植食者啃食[19]，更為重要的是，青藏高原地區(qū)晝夜氣溫波動較大且生長季短暫，花冠永久性閉合可以保護生殖器官免受低溫傷害，使子房內(nèi)部溫度趨于穩(wěn)定，促進花粉管的伸長，加速受精胚珠的生長，為種子在較短時間內(nèi)發(fā)育成熟提供保障，這對于種群后期開放的花尤為重要[9-10，19，29].

在生長季晝夜溫差波動大，夏季暴雨頻發(fā)的高山地區(qū)，溫度、降水等非生物因素在高山植物花部特征演化中發(fā)揮著重要作用[30].喉毛花的花冠閉合現(xiàn)象是應對高山地區(qū)惡劣生境和極端氣候條件的一種適應性進化策略.喉毛花的兩種花冠閉合現(xiàn)象在誘導機制以及對繁殖適合度的影響方面均存在差異，暫時性花冠閉合現(xiàn)象受低溫誘導，而永久性花冠閉合現(xiàn)象受到授粉因素的影響；暫時性花冠閉合現(xiàn)象通過影響花粉數(shù)量和質(zhì)量進而影響種子數(shù)量，而永久性花冠閉合現(xiàn)象通過影響授粉后胚胎發(fā)育過程影響種子質(zhì)量，兩種花冠閉合機制共同影響喉毛花的雌雄繁殖適合度.龍膽科植物中普遍存在的花冠閉合現(xiàn)象是自然界長期自然選擇的結果，是龍膽科植物能夠廣布于高山地區(qū)，對嚴酷的高山環(huán)境具有極強適應能力的原因之一.