董文豪，宮曉煒，鄭福英，劉永生，張磊，張小麗，陳啟偉，馬小軍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

抗生素是由微生物或高等動(dòng)植物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中所產(chǎn)生，或由人工合成的一類具有抗病原微生物能力的物質(zhì)[1].抗生素自其發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中發(fā)揮了很大的作用.但隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，近年來(lái)抗生素的濫用問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，細(xì)菌的耐藥性也在逐步升級(jí)，因此出現(xiàn)了許多多重耐藥菌和超級(jí)耐藥菌[2].由于耐藥菌對(duì)大部分抗生素均不敏感，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)可大肆繁殖，嚴(yán)重影響人類及動(dòng)物的健康.因此急需尋找一種抗生素的替代品，用于臨床及生產(chǎn).微生態(tài)制劑作為一種新的飼料添加劑來(lái)替代抗生素必將成為一種新趨勢(shì)[3].

我國(guó)對(duì)畜產(chǎn)品的安全要求不斷提高，2013年12月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了飼料添加劑目錄(2013)，其中允許作為飼料添加劑使用的微生物種類達(dá)到34種，相比飼料添加劑目錄(2008)增加了18種，表明將微生物作為飼料添加劑已逐漸被認(rèn)可，其應(yīng)用在我國(guó)也將進(jìn)一步普遍和廣泛[4].近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研制出多種益生菌活菌制劑，其基本指導(dǎo)思想是用人或動(dòng)物正常腸道菌群中的菌株，經(jīng)過(guò)篩選和人工繁殖，通過(guò)不同方法制成活菌制劑，然后再以口服投喂方式返回原環(huán)境發(fā)揮其生理作用[5].健康豬腸道內(nèi)的微生物比較復(fù)雜，益生菌以及條件性致病菌共存.益生菌隨著食物進(jìn)入動(dòng)物消化道后先到達(dá)胃部，通過(guò)一個(gè)含有胃蛋白酶的酸性環(huán)境后到達(dá)小腸，經(jīng)胰蛋白酶、胰脂肪酶等各種消化酶和膽鹽的消化作用，最后能在胃腸道中存活下來(lái)并達(dá)到一定數(shù)量才有可能發(fā)揮作用[6].因此，益生菌需要能夠耐受胃腸道環(huán)境，如芽孢桿菌在其生長(zhǎng)發(fā)育后期可形成一個(gè)抗逆性強(qiáng)的芽孢休眠體[7].

動(dòng)物體內(nèi)的益生菌主要有芽孢桿菌和乳酸菌兩大類，而芽孢桿菌因營(yíng)養(yǎng)要求低、易培養(yǎng)且具有較高抗逆性而被廣泛應(yīng)用[8].芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛存在于自然界，易從動(dòng)物腸道、糞便、土壤及水體中分離得到[9].芽孢桿菌是好氧菌，在動(dòng)物腸道中可生物奪氧，為乳酸菌提供賴以生存的厭氧環(huán)境，維持腸道微生態(tài)平衡[10].芽孢桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生各種酸類及細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，抑制腸道致病菌的生長(zhǎng)，在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可產(chǎn)生多種水解酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶等，從而補(bǔ)充腸道內(nèi)源酶的不足，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提高飼料利用率及生產(chǎn)性能[11].此外芽孢桿菌還能生成各種氧化酶類，促進(jìn)各類腐敗物質(zhì)的氧化分解，改善宿主健康和畜舍環(huán)境[12].可見(jiàn)，芽孢桿菌微生態(tài)制劑在醫(yī)藥和動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)上有很高的應(yīng)用價(jià)值[13].但由于制備技術(shù)不規(guī)范、菌株選取不優(yōu)良、作用效果不明確等問(wèn)題，其嚴(yán)重影響著微生態(tài)制劑的應(yīng)用和推廣發(fā)展.另外，益生菌是否具有耐藥性，是否存在可轉(zhuǎn)移的抗性基因是一個(gè)重要的安全問(wèn)題[14].歐洲食品安全局要求，在生產(chǎn)一種供人類使用的菌株時(shí)，不能存在任何可能對(duì)人類造成潛在風(fēng)險(xiǎn)的耐藥性獲得基因[15].盡管耐藥性細(xì)菌在食品生態(tài)系統(tǒng)中的傳播已成為全球關(guān)注的問(wèn)題，但只涉及了部分致病菌和乳酸菌，而有關(guān)芽孢桿菌屬的耐藥性研究較少，信息有限[16].

地衣芽孢桿菌作為益生菌已在世界范圍內(nèi)被廣泛開(kāi)發(fā)和應(yīng)用多年，是益生菌中公認(rèn)的安全菌株，具有開(kāi)發(fā)潛力的菌種之一.地衣芽孢桿菌作為一種益生菌，在植物病害防治、飼料添加劑、醫(yī)藥開(kāi)發(fā)、微生態(tài)制劑、環(huán)境污染治理等方面具有廣泛的應(yīng)用.另外，地衣芽孢桿菌還可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，對(duì)一些致病菌具有抑制能力，其微生態(tài)制劑在醫(yī)藥和動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)上有很高的應(yīng)用價(jià)值[17].而近年來(lái)對(duì)地衣芽孢桿菌的研究多在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)上，對(duì)其抑菌機(jī)理及抑菌成分的研究較少.因此本研究計(jì)劃從豬胃腸道及豬糞便中分離地衣芽孢桿菌，篩選出耐酸、耐膽鹽、抗逆性好，且具有產(chǎn)各種酶類功能的優(yōu)勢(shì)菌株，進(jìn)行生物學(xué)功能及其體外益生性能的研究，并檢測(cè)其是否具有抗藥性及耐藥基因，探究該菌對(duì)病原菌的抑制能力，為后期微生態(tài)制劑的研發(fā)提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 2020年8～12月分別在蘭州、劉家峽、甘南三地屠宰場(chǎng)采集豬糞便，豬小腸及豬胃內(nèi)容物，無(wú)菌塑封袋包裝后低溫運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室.

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 牛膽鹽、剛果紅染液、碘液均購(gòu)于北京Solarbio公司、革蘭氏染色試劑盒購(gòu)于Sigma公司、TaqDNA聚合酶、DNA Marker購(gòu)于諾唯贊公司；葡萄糖胰蛋白胨培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等均購(gòu)買于環(huán)凱微生物；淀粉培養(yǎng)基，羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基(CMC-Na)、干酪素培養(yǎng)基均購(gòu)于北京Solarbio公司；鮮血瓊脂平板購(gòu)于環(huán)凱微生物；藥敏紙片購(gòu)于杭州濱和微生物公司.

1.1.3 菌株 標(biāo)準(zhǔn)致病菌株主要用于檢測(cè)分離菌的抑菌能力，金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸桿菌ATCC25922、腸炎沙門氏菌(CVCC3374)均由蘭州獸醫(yī)研究所草食動(dòng)物細(xì)菌病實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 本試驗(yàn)所用引物均由西安擎科生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1.

表1 引物序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離與形態(tài)學(xué)觀察 取樣品80 ℃水浴加熱15 min，殺滅其他非芽孢菌.待樣品冷卻劃線接種于葡萄糖胰蛋白胨瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h.挑單個(gè)菌落劃線接種于新的平板，純化培養(yǎng)，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，包括菌落形狀、大小、顏色、光澤、隆起情況、透明度、邊緣整齊度等.并在鮮血瓊脂平板上劃線，觀察菌株是否有溶血性.并挑單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡油鏡觀察細(xì)菌類型及細(xì)菌形態(tài).

1.2.2 芽孢桿菌的鑒定 在平板上選擇形態(tài)不同的單個(gè)菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基.用特異性引物對(duì)菌液初步進(jìn)行PCR鑒定，引物見(jiàn)表1.PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，檢測(cè)目的條帶.以菌液為模板，用TaqDNA聚合酶，細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見(jiàn)表1.對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，有目的條帶的樣送至擎科生物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析.

1.2.3 耐酸和耐膽鹽試驗(yàn) 對(duì)分離鑒定出的地衣芽孢桿菌進(jìn)行耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)的篩選.

1.2.3.1 耐酸試驗(yàn) 取1 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，分別加入到9 mL pH為2.0、3.0、4.0的LB培養(yǎng)基中，以未經(jīng)過(guò)酸處理的菌液作為對(duì)照，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)2 h，梯度稀釋后涂平板， 37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率，篩選耐酸能力強(qiáng)的菌株

存活率=經(jīng)酸處理平板菌落計(jì)數(shù)÷未經(jīng)酸處理菌液平板菌落計(jì)數(shù)

1.2.3.2 耐膽鹽試驗(yàn) 選1.2.3.1中耐酸能力強(qiáng)的菌株， 取1 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液分別加入到9 mL的膽鹽濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，梯度稀釋后平板涂布，培養(yǎng)24 h進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，同上試驗(yàn)方法計(jì)算菌株存活率.

1.2.4 生化試驗(yàn) 復(fù)蘇菌株，平板劃線于鮮血瓊脂平板，培養(yǎng)24 h后挑單個(gè)菌落稀釋于麥?zhǔn)媳葷峁苤?，插入芽孢桿菌生化卡，用VITEK 2微生物鑒定系統(tǒng)鑒定.

1.2.5 藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè) 復(fù)蘇菌株，同1.2.4處理菌液，插入藥敏卡，用VITEK2微生物鑒定系統(tǒng)鑒定.分析結(jié)果，用藥敏紙片法進(jìn)一步對(duì)耐藥的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證.用特異性引物鑒定菌株是否攜帶耐藥基因，引物見(jiàn)表1.

1.2.6 產(chǎn)水解酶試驗(yàn)

1.2.6.1 產(chǎn)淀粉酶試驗(yàn) 挑單個(gè)菌落點(diǎn)種于淀粉培養(yǎng)基，每個(gè)平板點(diǎn)3個(gè)重復(fù)，一個(gè)用水做對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h，用碘液染5 min，測(cè)量菌落及透明圈直徑.

1.2.6.2 產(chǎn)纖維素酶試驗(yàn) 挑單個(gè)菌落點(diǎn)種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板， 37 ℃培養(yǎng)24 h，用0.2%剛果紅染液染30 min，用0.1 mol NaCl洗5 min，測(cè)量菌落及透明圈直徑.

1.2.6.3 產(chǎn)蛋白酶試驗(yàn) 同上挑單個(gè)菌落點(diǎn)種干酪素培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量菌落及透明圈直徑[18].

1.2.7 體外抑菌試驗(yàn) 以金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，沙門氏菌作為指示菌，用牛津杯法篩選6株地衣芽孢桿菌中對(duì)常見(jiàn)致病菌有抑制能力的菌株.配制LB瓊脂，待培養(yǎng)基冷卻，加入100 μL指示菌，搖勻后倒平板，在牛津杯中加入地衣芽孢桿菌400 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，篩選有抑菌能力的菌株[19].

1.2.8 耐高溫試驗(yàn) 分別取5 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，置于70、75、80、85、90、95、100 ℃水浴中處理10 min，處理完畢待樣品冷卻后，取100 μL進(jìn)行平板涂布，將未進(jìn)行高溫水浴處理的菌液作為對(duì)照，培養(yǎng)24 h后平板計(jì)數(shù)，計(jì)算菌株存活率.

1.2.9 對(duì)小鼠影響試驗(yàn) 選擇30～40 g(6～8周齡)昆明小鼠進(jìn)行試驗(yàn).將14只小鼠隨機(jī)分成2組，為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組7只.每組每只小鼠分別灌服200 μL無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基和200 μL的OD為0.8的地衣芽孢桿菌WBL009菌液.連續(xù)灌胃21 d，觀察并記錄小鼠活動(dòng)量、增質(zhì)量、有無(wú)腹瀉等.飼喂結(jié)束后，將各組小鼠摘眼球采血法采血并處死，解剖小鼠取脾臟和胸腺，稱質(zhì)量并記錄，計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù).解剖觀察各組小鼠內(nèi)臟器官是否有肉眼可見(jiàn)的病理變化[20].

器官指數(shù)=器官質(zhì)量/體質(zhì)量

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離鑒定

2.1.1 芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)特征及鑒定結(jié)果 本試驗(yàn)共分離出64株芽孢桿菌，其中地衣芽孢桿菌26株，枯草芽孢桿菌9株，解淀粉芽孢桿菌8株、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌6株、貝萊斯芽孢桿菌5株、沙福芽孢桿菌4株、短小芽孢桿菌3株、高地芽孢桿菌2株、蘇云金芽孢桿菌1株等，具體結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 芽孢桿菌形態(tài)特征及鑒定結(jié)果

2.1.2 培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)特征 地衣芽孢桿菌在葡萄糖胰蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)24 h形成2～3 mm大小的白色菌落，邊緣不整齊，表面不光滑，有褶皺.在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)24 h在培養(yǎng)基表面形成一層白色薄膜.在鮮血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，無(wú)溶血現(xiàn)象.

2.1.3 特異性引物PCR鑒定 用地衣芽孢桿菌特異性引物PCR鑒定結(jié)果顯示，有大小約 1 287 bp的目的條帶，初步判斷該菌株為地衣芽孢桿菌.

圖1 地衣芽孢桿菌菌落及革蘭氏染色鏡檢1000×

M：DL2000 Marker;1～6:WBL001、WBL002、WBL005、WBL009、WBL010、WBL014 ;-：陰性對(duì)照.

2.1.4 16s rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，條帶大小均在1 500 bp左右，測(cè)序后在NCBI網(wǎng)站比對(duì)核苷酸序列，分析結(jié)果.比較并分析同源性較高的序列，構(gòu)建分離出的地衣芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹.

圖3 地衣芽孢桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2 耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)

2.2.1 耐酸試驗(yàn) 通過(guò)將26株地衣芽孢桿菌在pH 2.0、2.5、3.0處理2 h后，計(jì)算存活率，發(fā)現(xiàn)僅有6株仍能存活.此6株菌的耐酸能力差異較大.菌株WBL009在pH 2.0處理2 h后，仍能存活，存活率為35.8%，耐酸能力較強(qiáng).

2.2.2 耐膽鹽試驗(yàn) 計(jì)算6株耐酸能力強(qiáng)的菌株在不同濃度膽鹽處理后的存活率，6株菌株的耐膽鹽能力不同.其中菌株WBL009耐膽鹽能力最強(qiáng)，在0.3%膽鹽培養(yǎng)基中處理12 h的存活率為51.6%.

2.3 生化試驗(yàn)

根據(jù)VITEK2系統(tǒng)的生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，93%的鑒定概率為地衣芽孢桿菌.

表3 生化試驗(yàn)結(jié)果

縮寫與中文名稱Abbreviations and Chinese and English names：

AGAL：α-半乳糖苷酶 α-galactosidase ；AGLU：α-葡萄糖苷酶 α-glucosidase；AMAN：α-甘露糖苷酶 α-mannosidase；APPA：丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶 Alanine-phenylalanine-proline arylaminase；APS：過(guò)硫酸銨 Ammonium persulfate；AspA：L-天冬氨酸芳胺酶 L-aspartic acid arylaminase；BalaA：丙氨酸芳胺酶 Alanine arylamine enzyme；BGAL：β-半乳糖苷酶 β-galactosidase ；BGLU：β-葡萄糖苷酶 β-glucosidase；BMAN：β-甘露糖苷酶 β-mannosidase；BNAG：N-乙酰-β-D-葡萄糖氨酶 N-acetyl-β-D-glucosaminase；BXYL：β-木糖苷酶 β- xylosidase；CDEX：環(huán)糊精 cyclodextrin；Cleocin：氯林霉素 Clidamycin Hydrochloride；dGAL：D-半乳糖 D-galactose；dGLU：D-葡萄糖 D-glucose；dMAN：D-甘露醇 D-mannitol；dMLZ：D-松三糖 D-three sugar pine；dMNE：D-甘露糖 D-mannose；dRIB：D-核糖 D-ribose；dTAG：D-塔格糖 D-tager sugar；dTRE：D-海藻糖 D-trehalose；ESC：七葉靈水解 D-mannitol；GlyA：氨基酸芳胺酶 L-aspartic acid arylaminase；GLYG：糖元 Glycogen；INO：肌醇 Inositol；INU：菊粉 Inulin；IRHA：L-鼠李糖 L-rhamnose；KAN：卡那霉素耐受 Kanamycin tolerance；LeuA：亮氨酸芳胺酶 Leucine arylaminase；LysA：L-賴氨酸芳胺酶 L-lysine arylaminase；MdG：甲基葡萄糖甙酸化 Methylglucoside acidification；MdX：甲基-D-木糖苷 Methyl-D-xyloside；MTE：麥芽三糖 L-lysine arylaminase；NaCI 6.5%：6.5%氯化鈉生長(zhǎng) 6.5% NaCl growth；NAG：N-乙酰-D-葡萄糖氨 N-acetyl-D-glucosamine；OLD：竹桃霉素耐受 Tolerance to dodomycin；PHC：磷?；S生素 Phosphoacyl vitamins；PheA：苯丙氨酸芳胺酶 Phenylalanine arylaminase；PLE：古老糖 Old sugar；POLYB_R：多粘菌素B耐受 D-three sugar pine；ProA：脯氨酸芳胺酶 Proline arylaminase；PSCNa：腐胺同化 Putrescine assimilation；PVATE：丙酮酸鹽 Pyruvic acid salt；PyrA：吡咯烷基芳胺酶 Pyrrolidylarylaminase；TTZ：多粘菌素B耐藥 D-mannose；TyrA：酪氨酸芳胺酶 Tyrosine arylaminase.

2.4 藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，6株地衣芽孢桿菌對(duì)大多數(shù)抗生素均敏感，但均對(duì)氯林霉素耐藥.結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)特異性引物對(duì)地衣芽孢桿菌潛在耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，引物見(jiàn)表1.對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，其中ermC基因有目的條帶，speG和ereAB無(wú)條帶.說(shuō)明介導(dǎo)6株地衣芽孢桿菌氯林霉素耐藥的原因是攜帶了ermC耐藥基因.

2.5 產(chǎn)水解酶試驗(yàn)

根據(jù)產(chǎn)酶試驗(yàn)結(jié)果顯示，6株地衣芽孢桿菌產(chǎn)酶能力不同，其中菌株WBL009能產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶，產(chǎn)蛋白酶結(jié)果不明顯.

M：WBL2000 Marker;1～6:WBL001、WBL002、WBL005、WBL009、WBL010、WBL014 ;-：陰性對(duì)照.

2.6 體外抑菌試驗(yàn)

由地衣芽孢桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌及大腸桿菌的體外抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅有菌株WBL009對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，抑菌環(huán)直徑為10.75 mm,其他菌株均無(wú)明顯抑菌效果.

2.7 耐高溫試驗(yàn)

將菌株WBL009培養(yǎng)12 h的菌液經(jīng)不同溫度處理10 min后，稀釋涂布計(jì)數(shù)，在不同溫度下的存活率見(jiàn)表5.

A:菌株WBL009產(chǎn)淀粉酶試驗(yàn);B:菌株WBL009產(chǎn)纖維素酶試驗(yàn).

圖6 菌株WBL009體外抑菌試驗(yàn)

表5 菌株WBL009的耐高溫存活率

圖7 耐高溫存活率曲線

2.8 對(duì)小鼠影響試驗(yàn)

通過(guò)用菌株WBL009連續(xù)21 d飼喂小鼠，對(duì)照組和試驗(yàn)組小鼠均無(wú)不良反應(yīng)，精神正常，無(wú)腹瀉情況和中毒癥狀.解剖后肉眼觀察小鼠內(nèi)臟器官正常，分析器官指數(shù)，發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)小鼠胸腺(P<0.01)和脾臟(P<0.05)的發(fā)育有促進(jìn)作用，且對(duì)小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)有顯著提高作用(P<0.01).

3 討論

研究表明，在動(dòng)物飼料中添加適當(dāng)比例的微生態(tài)制劑，可產(chǎn)生大量寡肽、谷氨酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶等多種水解酶，具有調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能，降低料肉比，提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，減少疾病的發(fā)生等功效[21].

A:小鼠胸腺指數(shù);B:小鼠肝臟指數(shù);C:小鼠脾臟指數(shù);D:小鼠腎臟指數(shù);E:小鼠灌胃21d體質(zhì)量增長(zhǎng).

因?yàn)橐紤]微生態(tài)制劑的工業(yè)生產(chǎn)加工及其在動(dòng)物胃內(nèi)及腸道內(nèi)的耐受能力，需篩選出能耐受低pH，耐受膽鹽及高溫條件的菌株.本試驗(yàn)中篩選的地衣芽孢桿菌WBL009在pH值為2.5時(shí)的人工胃液中處理2 h 后存活率為35.8%，在膽鹽濃度為0.3%處理12 h后存活率為51.6%，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力.藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，地衣芽孢桿菌對(duì)克林霉素有一定的耐受性，而對(duì)于絕大多數(shù)的藥物是敏感的，耐藥基因篩查發(fā)現(xiàn)，ermC是導(dǎo)致地衣芽孢桿菌對(duì)克林霉素耐藥的主要原因.在使用益生菌時(shí)，應(yīng)避免與其敏感的抗生素同時(shí)使用，這也是保證益生菌發(fā)揮作用的關(guān)鍵一步.根據(jù)Jeong等[16]的研究報(bào)道，證實(shí)ermC是地衣芽孢桿菌和副地衣芽孢桿菌對(duì)紅霉素和克林霉素交叉耐藥的主要原因，ereAB主要發(fā)揮對(duì)紅霉素的抗性作用，speG則主要發(fā)揮對(duì)克林霉素的抗性作用.表明芽孢桿菌對(duì)克林霉素的耐藥性是一種固有的特性，這種特性可以通過(guò)缺失耐藥基因的結(jié)構(gòu)基因或啟動(dòng)子而喪失，因此在機(jī)體內(nèi)發(fā)生耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的概率較低，作為益生菌相對(duì)安全.

金黃色葡萄球菌作為引起機(jī)體各類感染的最常見(jiàn)病原菌之一，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)又是超級(jí)耐藥菌，在世界范圍內(nèi)引起巨大危害.益生菌在腸道內(nèi)通過(guò)減少病原菌的腸道定植、限制炎癥反應(yīng)和加強(qiáng)腸道屏障來(lái)預(yù)防性地抑制病原菌感染[23].近年來(lái)相關(guān)的報(bào)道主要為凝結(jié)芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，本研究篩選的地衣芽孢桿菌WBL009對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，可作為益生菌控制耐藥菌，為后期試驗(yàn)提供研究基礎(chǔ).

通過(guò)用菌株WBL009連續(xù)21 d飼喂小鼠，分析體質(zhì)量和免疫器官變化發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)有顯著提高作用，且對(duì)免疫器官的發(fā)育有促進(jìn)作用.免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育和成熟依賴于抗原的刺激；芽孢桿菌的菌體成分如胞壁糖、肽聚糖、多肽和蛋白質(zhì)等，可以作為抗原刺激腸道或以免疫佐劑的形式作用于動(dòng)物免疫器官，直接促進(jìn)免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育[22].

綜上所述，本研究中篩選出的1株具有較強(qiáng)抗逆性、有產(chǎn)水解酶能力，且對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用的地衣芽孢桿菌WBL009具有良好的體外益生性能.后期將對(duì)該菌株的抗菌物質(zhì)成分、該菌在動(dòng)物體內(nèi)的益生性能、對(duì)動(dòng)物機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力等進(jìn)行下一步研究，為其作為益生菌的候選菌株應(yīng)用于微生態(tài)制劑的生產(chǎn)提供依據(jù)和材料.