周一卉，李香月，商方方，王濤，谷旭

(1.北京市石景山區(qū)疾病預防控制中心，北京 石景山 100043；2.中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081)

氯霉素(chloramphenicol，CAP，圖1)，是一種酰胺醇類廣譜抗生素，抗菌效果好且價格低廉，我國從20世紀90年代將其作為飼料添加劑加入動物飼料中防治動物疾病，用于提高畜牧養(yǎng)殖業(yè)的產量[1-3].隨著氯霉素臨床的廣泛應用，再生障礙性貧血、胃腸道不適、免疫力下降等由氯霉素引起的一系列不良反應的報道日漸增多[4-5].2002年，西南農業(yè)大學相關研究表明，蛋雞在多劑量內服氯霉素后，在雞蛋中的藥動力學特征為易吸收，因此在雞蛋中易形成殘留[6]，一旦通過食物鏈的傳遞，最終進入到人體內形成富集，將不同程度地對食用者的身體健康造成損害.

圖1 氯霉素結構

日本、歐盟、美國等發(fā)達國家都已經將氯霉素列為禁用藥物.隨著檢測技術的不斷發(fā)展，氯霉素的檢出限也逐步降低[7].歐盟在96/23/EC指令中禁止在動物上使用氯霉素，動物源性產品中氯霉素的最高殘留限量(MRL)為10 μg/kg[8]，檢測方法設定最低要求性能限定(MRPL)為0.3 μg/kg[9].2019年，農業(yè)農村部公布第250號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定，養(yǎng)殖動物禁止氯霉素使用，不得在動物性食品中檢出[10].目前，針對動物源性食品中氯霉素檢測方法[11]有酶聯(lián)免疫吸附法、分子印跡法、分子信標法、以及被廣泛應用的氣相色譜串聯(lián)質譜法和高效液相色譜串聯(lián)質譜法等.葉江雷等[12]應用免疫膠體金法檢測水產品中氯霉素殘留，就如何降低“假陰性”率和提高可靠性，以及如何改進前處理過程提出了建議；張慧潔等[13]建立以氯霉素為模板分子，氧化石墨烯為載體，在碳量子點中摻雜氮、硫元素，采用沉淀法制備氯霉素分子印跡聚合物，并作為熒光探針，對氯霉素殘留進行檢測，檢出限為6×10-4μmol/L.

雞蛋蛋液中含有大量蛋白質、脂類，相較其他組織雞蛋基質更為復雜，一方面質譜檢測基質效應較強，另一方面目標物與蛋白質相結合難以解離，降低提取效率.氯霉素雖然已經禁止用于動物性食品，但是現(xiàn)行的國標檢測方法均是針對動物肌肉組織，還未見關于禽蛋中氯霉素的檢測方法.基于HPLC-MS/MS方法靈敏度高，定性準確的特點[14]，本研究建立并優(yōu)化禽蛋中氯霉素殘留的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(SPE-UPLC-MS/MS)分析檢測方法，以期提高雞蛋中氯霉素殘留風險監(jiān)測方法準確度和精密度，為雞蛋中氯霉素膳食暴露進行風險評估提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITYTMUPLC超高壓液相色譜、Xevo TQ 三重四極桿質譜儀，配有電噴霧離子源(美國Waters公司)；BS 224 S分析天平(0.1 mg～220 g,德國Sartorius公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Multi Reax渦旋混勻儀(德國Heidolph公司)；14 000 r/min冷凍離心機(3-30ks,德國Sigma公司)；氮吹儀(TTL-DCII型,上海德兆儀器儀表有限公司)；HLB固相萃取柱(3 cc,60 mg,美國 Waters公司).

1.2 試劑

氯霉素標準物質(純度≥99.8%， 德國 Dr.Ehrenstorfer 公司)；氯霉素-D5同位素內標(純度≥95%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific公司)，乙酸乙酯(色譜純，美國Dikma公司)；甲酸、氨水(色譜純，美國MREDA公司)；氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純，西亞化學科技(山東)有限公司)；鹽酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；純水處理終端機(Milli Q,美國Millipore公司).

1.3 標準溶液配制及標準曲線繪制

準確稱取氯霉素及氯霉素-D5內標，用甲醇作為溶劑，配制1 mg/L的標準儲備液，避光保存于-20 ℃冰箱.用10%甲醇水分別將氯霉素和氯霉素-D5內標標準儲備液稀釋為100 μg/L標準使用液，準確移取氯霉素標準使用液2、5、10、50、100、200、500、1 000 μL至10 mL容量瓶中，加入200 μL同位素內標使用液，用10%甲醇水定容至刻度線，配制濃度范圍0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L標準系列，臨用現(xiàn)配.

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的采集 雞蛋樣品隨機采購于北京市各區(qū)縣商超、農貿市場等，3年共計采購170批次(表1).

表1 2016～2020 年北京市售雞蛋中氯霉素監(jiān)測情況

1.4.2 樣品的提取與凈化 根據(jù)氯霉素在堿性條件下可被乙酸乙酯萃取的特點，本研究同時比對了液液萃取法(LLE)和固相萃取法(SPE)的提取凈化效率.

SPE法：將雞蛋破殼后混勻蛋液，準確稱取5.00 g(精確到0.01 g)待測液體試樣于50.0 mL離心管中，加入100 μg/L同位素內標工作液40 μL.加入5 mL 4% NaCl溶液和5 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取5 min，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋混勻，以10 000 r/min離心2 min，取上層有機相，待固相萃取凈化.

HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL 水活化平衡.加入5 mL樣品有機相提取液至HLB柱內，待樣品過柱后，用5 mL水淋洗，用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，在50 ℃下用氮氣吹干，再加入1 mL 10%甲醇/水溶液混勻超聲 1 min，10 000 r/min離心后上清液過 0.22 μm濾膜，用UPLC-MS/MS 分析氯霉素.

LLE法：在待測樣液中加入5 g無水硫酸鈉后，用15 mL乙酸乙酯，0.45 mL氫氧化銨，反復提取3次，合并上清液，定容后取一定量用正己烷去除脂類，氮氣吹干，殘留物用1 mL 10%甲醇/水溶液混勻超聲1 min，10 000 r/min離心后上清液過0.22 μm濾膜，供儀器檢測.

1.5 色譜和質譜檢測條件

1.5.1 色譜條件 Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱溫35 ℃，進樣體積為5 μL，梯度洗脫，流動相A為水和0.1%甲酸水(V/V)進行比對，流動相B分別選擇了乙腈、甲醇進行比對，流速為0.25 mL/min.洗脫程序為:0～0.5 min,90%～90% A;0.5～2.0 min,90%～10% A;2.0～3.0 min,10%～90% A;3.0～3.5 min,10%～90%A;3.5～5.0 min,90%A.

1.5.2 質譜條件 電噴霧離子源；ESI-模式；毛細管電壓0.5 kv，離子源溫度150 ℃，脫溶劑溫度400 ℃.氯霉素定性定量離子對及相關數(shù)據(jù)見表2.

表2 液相色譜-串聯(lián)質譜分析參數(shù)

1.6 添加回收實驗

對24份空白雞蛋樣本，分別在定量限，4倍定量限，10倍定量限，20倍定量限，40倍定量限和50倍定量限6個濃度水平開展加標回收及精密度試驗，每個濃度4個重復.

1.7 數(shù)據(jù)處理方法

樣品中的氯霉素含量用式(1)計算得出，其中X為樣品中氯霉素殘留量(μg/kg)；V為測試液定容體積(mL)；m為測試液所代表的樣品質量(g)，A為樣品溶液中氯霉素的峰面積；Ai為樣品溶液中氯霉素內標物的峰面積；Ci為樣品溶液中氯霉素內標的濃度(μg/L).

(1)

1.8 居民雞蛋中氯霉素膳食暴露風險評估方法

1.8.1 風險評估數(shù)據(jù)來源 雞蛋中氯霉素殘留量(μg /kg)采用試驗測定數(shù)據(jù)；目標人群平均體質量(kg)采用2014年北京市國民體質監(jiān)測結果公報[13]中發(fā)布的各年齡及性別人群的體質量，見表4；雞蛋消費數(shù)據(jù)來源于北京地區(qū)居民膳食調查[14].

1.8.2 膳食暴露量評估 通過食用被污染的食物是人群暴露的主要途徑，本試驗以雞蛋為單一的氯霉素暴露途徑，以安全指數(shù)[15]進行慢性風險評估，安全指數(shù)IAPSC依照式(2)計算；EDIC為危害物日攝入量(μg/kg).本著風險最大化原則，本研究采用試驗測得的氯霉素殘留最大量與北京地區(qū)居民每日雞蛋攝入量的乘積作為危害物日攝入量，進行測評；SIc為安全攝入量(μg/kg))，根據(jù)不同的危害物可采用ADI、PTWI、RDI或RfD等數(shù)據(jù)；f為校正因子，如果安全攝入量采用ADI、RDI或RfD等以日攝入量為基礎的數(shù)據(jù)時f=1，如果安全攝入量采用PTWI等周攝入量為基礎的數(shù)據(jù)時f=7.mB為體質量(kg).當IAPSC遠小于1時，安全；IAPSC小于等于1時，風險可接受；當IAPSC大于1時，應當進入風險管理的預警程序中.

(2)

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

采用Waters-三重四極桿串聯(lián)質譜儀(ESI 源) ，在多反應監(jiān)測(MRM) 模式下對氯霉素(相對分子質量為 323.14)的質譜條件進行選擇優(yōu)化.在負離子模式下，氯霉素進入一級質譜后，產生穩(wěn)定的[M-H]-分子離子峰，得到 m/z 為321.16的母離子，符合含有兩個Cl原子9∶6∶1的豐度比特點.氯霉素二級質譜的特征碎片m/z 為 151.89和256.90(圖2)，321.16/151.89碎片離子強度更高，因此將其作為定量離子，二者豐度比為2∶1.

圖2 氯霉素質譜圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別比較了乙腈和甲醇2種流動相條件，并加入甲酸改性，進行梯度洗脫時氯霉素的響應及分離度.實驗結果表明，以乙腈為有機相，氯霉素的色譜峰有明顯的拖尾；以甲醇為有機相時得到色譜峰峰形更為對稱、峰寬更窄；在有機相和水相中同時添加 0.1%甲酸可以使色譜峰峰形更為尖銳，且響應強度更高，見圖3.

A:乙腈-水；B:0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水；C:0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水.

2.3 前處理條件的優(yōu)化

雞蛋的基質中含有大量的蛋白質和脂類，且呈現(xiàn)液體狀態(tài)，待測物與蛋白質相結合溶于蛋液中，難于解離，提取效率低，質譜分析時基質效應嚴重，凈化條件復雜，然而過于繁瑣的凈化過程也會造成目標待測物提取效率的降低，影響方法的準確性.

分別應用兩種方法選取線性范圍中段濃度，10倍定量限和15倍定量限，開展加標回收試驗，結果見圖4.經過對照試驗，固相萃取法試驗回收率更好，步驟更為簡單，使用更少的溶劑，對環(huán)境的污染更小，故本研究最終采用固相萃取法進行樣品前處理.

圖4 不同凈化方式對雞蛋中氯霉素回收率的影響

試驗采用了空白提取液加入標準的方法，比較了兩種方法的基質效應.分別測定2種方法雞蛋空白基質提取液加標1.0 μg/L與同濃度純溶劑中的響應值，通過兩者的比值評價基質效應(ME).ME<0.8說明基質對于待測物有很強的抑制作用；0.81.2說明基質對于待測物有增強作用.SPE提取法ME在0.95～1.01之間，LLE提取法ME在0.82～0.89之間，結果表明兩種方法基質效應均不明顯，但是SPE提取法更優(yōu)，說明HLB固相萃取柱能更加有效的去除雞蛋基質中的脂類及蛋白質.

2.4 線性關系、回收率、精密度及質量控制

以氯霉素與氯霉素內標峰面積比值與內標濃度乘積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線.計算公式見式(3)，其中A、Ai、C、Ci同式(1).根據(jù)式(3)求得標準曲線a和b，以及相關系數(shù)r.標準系列溶液按照濃度由低到高依次進樣檢測，在0.1～5 μg/L范圍內有較好的線性關系，線性方程為Y=854.44X-62.86，相關系數(shù)r為0.999 5，檢出限為0.008 μg/kg，定量限為0.02 μg/kg.對雞蛋樣本添加6種濃度水平，進行加標回收試驗，每種進行4個水平測定，結果見表3所示.

表3 氯霉素的回收率和標準偏差

(3)

2.5 不同人群的膳食風險評價

根據(jù)北京地區(qū)居民膳食調查[14]，雞蛋的日均攝入量為39.3 g/d，由于蛋殼作為非可食用部分，在雞蛋質量中占比較少，故忽略不計，因此，EDIC值為0.055 μg/d(試驗獲得雞蛋中氯霉素殘留最大值1.4 μg/kg與0.039 3 kg/d的乘積).世界衛(wèi)生組織以及聯(lián)合國糧農組織[16-17]未規(guī)定氯霉素安全攝入量限值(JECFA 和JMPR認為添加劑的估計攝入量遠遠低于任何以常規(guī)方法確定的數(shù)值)，同樣，我國也沒有對氯霉素安全攝入量做出規(guī)定；歐洲食品安全局[18]公布歐洲各國氯霉素慢性膳食暴露限值為幼童11～17 ng/(kg·d)，成人2.2～ 4.0 ng/(kg·d)，本著風險最大化原則，SIC選用低限進行研究，幼童11 ng/(kg·d)，成人2.2 ng/(kg·d).安全攝入量采用日均值，因此校正因子f為1.代入式(2)，計算得出北京地區(qū)不同年齡段，不同性別居民針對雞蛋中氯霉素膳食暴露風險安全指數(shù)見表4.

A：2 μg/L標準溶液；B： 2 μg/L空白加標樣品；C：1 μg/L陽性樣品；D：空白樣品.

表4 氯霉素在雞蛋中的膳食風險評估結果

3 結論

本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定雞蛋中氯霉素的方法，同位素內標法定量，降低了質譜分析過程中基質效應對檢測結果的影響，無內源性干擾.方法穩(wěn)定性好，準確性高，回收率比較理想，完全可以滿足目前風險監(jiān)測工作檢測要求.通過對2016、2018和2020年北京市市售雞蛋的監(jiān)測，雞蛋中氯霉素在居民膳食暴露中風險較低，對3～6歲和20～69歲不同人群膳食暴露的風險均在可接受范圍內.