欽越 陳志 楊章平

摘要：CRISPR/Cas9首次在細菌中被發(fā)現(xiàn)，是適應性免疫系統(tǒng)的一部分，現(xiàn)已廣泛用于工程改造基因組中激活或抑制基因表達。同時，CRISPR/Cas9有望通過提供一種有效的技術來剖析癌癥發(fā)生的機制，確定藥物開發(fā)的靶標，并可能為基于細胞的療法提供支撐以加速癌癥的研究。對CRISPR/Cas9技術的發(fā)展歷史和應用范圍做了概述及展望，以期為CRISPR/Cas9技術的后續(xù)發(fā)展提供思路。

關鍵詞：CRISPR/Cas9;基因編輯;哺乳動物

長期以來，基因療法一直被寄予希望可以治療或糾正人和動物體內(nèi)的各種疾病和缺陷。隨著簇狀規(guī)則間隔短回文重復序列（CRISPR）的發(fā)現(xiàn)、基于CRISPR的原核生物適應性免疫系統(tǒng)（CRISPR相關系統(tǒng)，Cas）的機制以及它的再利用成為一種有效的基因編輯工具，使得分子生物學領域發(fā)生了革命性的變化，并激發(fā)了人們對新的和改進的基因治療的興趣。CRISPR/Cas9（規(guī)律性成簇間隔的短回文重復序列/CRISPR相關蛋白）系統(tǒng)是繼ZFN、TALENs等基因編輯技術推出后的第三代基因編輯技術，是現(xiàn)有基因編輯和基因修飾里面效率最高、最簡便、成本最低的技術之一，已成為當今最主流的基因編輯系統(tǒng)。

一、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的起源

1987年，日本科學家在研究大腸桿菌的時候發(fā)現(xiàn)其基因組上有一段29bp的序列反復出現(xiàn)了數(shù)次且彼此之間被一段 32bp的序列所隔開。1993年，西班牙科學家Francisco Mojica在地中海噬鹽菌中也同樣發(fā)現(xiàn)了這段重復序列。隨著后續(xù)的研究，他在二十多種不同的微生物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了這種重復DNA結構，并將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列 （Clustered Regulation Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。通過對比多種細菌的幾千段CRIPSR序列，發(fā)現(xiàn)在 CRIPSR序列中存在許多片段與病毒的基因組序列高度一致，雖然不是完整的病毒基因組序列，但這些序列被夾在一段細菌精心設計的重復序列中。進一步的研究證實，這些與病毒基因組高度一致的序列來自于噬菌體。2007年，CRISPR序列對于細菌免疫系統(tǒng)的功能在嗜熱鏈球菌中得以證明。

2011年，美國化學家詹妮弗，杜德納與法國生物化學家埃馬紐埃爾，卡彭蒂耶合作開發(fā)CRISPR技術，并于一年后在《Science》雜志中首次指出，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體外實驗中能定點對DNA進行切割，顯著提升了基因編輯的效率。2013年，哈佛大學醫(yī)學院教授喬治。徹奇和華人科學家、麻省理工學院教授、博德研究所資深研究員張鋒分別相繼證明了CRISPR序列與Cas9蛋白結合可以在人類細胞中高效地定位、剪切和修改基因組。

二、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由Cas9蛋白和單鏈向?qū)NA（sgRNA）所組成，其中Cas9蛋白起切割DNA雙鏈的作用，sgRNA起向?qū)У淖饔?，在sgRNA的向?qū)峦ㄟ^堿基互補配對原則，Cas9蛋白可對不同的靶部位進行切割，實現(xiàn)DNA的雙鏈斷裂。

（一）CRISPR高度可變的間隔區(qū)的獲得

當有外源DNA人侵細胞時，Cas1和Cas2編碼的蛋白會對該DNA進行識別，并在過程中尋找到該DNA的PAM區(qū)域，CRISPR將以該PAM區(qū)域附近的DNA序列作為候選的原型間隔序列。在識別后，Cas1/2蛋白復合物會對選擇出的間隔序列進行剪切處理，同時，會有一部分酶將原間隔序列插人到CRISPR序列的前導區(qū)下游區(qū)域。在通常情況下，斷裂的DNA會采用高效的非同源末端連接方式（NHEJ）進行自我修復，將被剪切的雙鏈缺口閉合。經(jīng)過該階段，一段新的間隔序列就被添加到了基因組的CRISPR序列之中。

（二）CRIPSR基因座的表達

CRISPR序列的前導區(qū)會調(diào)控序列轉錄產(chǎn)生pre-CRIS-PR RNA，tracrRNA（反式激活crRNA）在此時也會被轉錄出來與pre-crRNA序列進行互補。pre-CRISPR RNA通過堿基互補配對與tracrRNA形成雙鏈RNA并與Cas9編碼的蛋白組裝成一個復合體。該復合體的目的是根據(jù)外源DNA的類型選取不同的間隔序列RNA，并在核糖核酸酶III（RNaseIII）的協(xié)助下進行剪切，最終形成一段短小的CRISPR RNA（包含單一種類的間隔序列RNA以及部分重復序列區(qū)）。

（三）CRISPR/Cas系統(tǒng)活性的發(fā)揮

由CRISPR RNA，Cas9以及tracrRNA組成的復合物將識別整個外源DNA序列，并識別出與crRNA互補的原間隔序列。這時，復合物將定位到PAM/原間隔序列的區(qū)域，DNA雙鏈將被解開，形成R一Loop。此時crRNA與互補鏈相連接，而另一條鏈則保持游離狀態(tài)。Cas9蛋白隨后會精準的平端切割位點位于PAM上游3個核苷酸的位置，形成平末端產(chǎn)物。Cas9蛋白的HNH結構域負責切割與crRNA互補配對的那一條DNA鏈，而RuvC結構域負責切割另外一條非互補DNA鏈。最終在Cas9的作用下DNA雙鏈斷裂（DSB），外源DNA的表達被沉默。

三、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應用

（一）基因敲除（Knock-out）

在通常情況下，當細胞出現(xiàn)DNA雙鏈斷裂的情況時，會采用高效的非同源末端鏈接（Non-homologous end join-ing，NHEJ）對斷裂的DNA進行修復。但是，在修復過程中通常會發(fā)生堿基插人或缺失的錯配現(xiàn)象，造成移碼突變，使靶標基因失去功能。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以利用Cas9蛋白對靶基因組進行剪切，形成DNA的雙鏈斷裂，進而實現(xiàn)基因敲除。

Zhou等川利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對山羊成纖維細胞中的BLG位點進行敲除，獲得p-乳球蛋白（BLG）基因敲除山羊，通過進一步研究發(fā)現(xiàn)在敲除山羊的乳汁中BLG蛋白表達極顯著降低，為羊奶的品質(zhì)優(yōu)化提供了有效依據(jù)。G.N.Singina等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了PAEP和LOC100848610基因敲除的胚胎成纖維細胞系以用于生產(chǎn)不合成p-乳球蛋白的牛的轉基因后代。Watanabe等使用CRISPR / Cas9在人胰腺導管腺癌（PDAC）細胞系中敲除 KDM6A，證明KDM6A缺失的細胞表現(xiàn)出侵襲性表型。Yuza等4證實，敲除PAN02細胞中的SphK1基因可以促進細胞的增殖和遷移。利用CRISPR /Cas9技術，Chugh等日將 C1CALT1基因從PDAC細胞中敲除，發(fā)現(xiàn)細胞的生長速度、遷移率等指標的表達都有顯著提高。在胰腺癌的研究中，也有許多基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究，即敲除胰腺癌細胞的特異性基因，然后觀察不同表型的變化。

（二）基因敲入（Knock-in）

當DNA雙鏈斷裂后，如果有DNA修復模板進人到細胞中，基因組斷裂部分會依據(jù)修復模板進行同源重組修復（HDR），從而實現(xiàn)基因敲人。修復模板由需要導人的目標基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）組成，同源臂的長度和位置由編輯序列的大小決定。DNA修復模板可以是線性/雙鏈脫氧核苷酸鏈，也可以是雙鏈DNA質(zhì)粒。HDR修復模式在細胞中發(fā)生率較低，通常小于10%。為了增加基因敲人的成功率，目前有很多科學家致力于提高HDR效率，將編輯的細胞同步至HDR最活躍的細胞分裂時期，促進修復方式以HDR進行;或者利用化學方法抑制基因進行NHEJ，提高HDR的效率。魏姣舊等通過實驗發(fā)現(xiàn)在雞胚中注射腺病毒載體比慢病毒載體具有更高的轉染效率，通過CRISPR /Cas9腺病毒載體注射可以在雞胚ATP5E位點實現(xiàn)EGFP基因敲人。Xie等利用CRISPR/Cas9技術，成功地將豬RSAD2基因（pRSAD2）定點插人到豬rosa26（pR0-SA26）位點，獲得了pRSAD2基因敲人PK一15細胞（pRSAD2-KI）和豬胎兒成纖維細胞（PFFs），并從 pRSAD2-KI豬分離的成纖維細胞減少了CSFV的感染。Chu等圖應用CRISPR/Cas9技術將8-11kb插人片段敲人C57BL/6小鼠受精卵的Rosa26中，在此基礎上建立了Cre/loxP依賴性進行Cas9表達的新小鼠系。

（三）基因抑制/激活（Repression or Activation）

Cas9具有獨立切割和結合靶基因的能力，其能夠通過點突變的方式使RuvC-和HNH一兩個Cas9的結構域失活，形成的dCas9只能在sgRNA的介導下結合靶基因，而不具備剪切DNA的功能。因此，將dCas9結合到基因的轉錄起始位點，可以阻斷轉錄的啟動，從而抑制基因表達;將dCas9結合到基因的啟動子區(qū)域也可以結合轉錄抑制/活化物，使下游靶基因轉錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9nickase的不同之處在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不會對基因組DNA造成永久性的改變。陳渙蘭等9通過基因抑制的方法構建了1種雙質(zhì)粒CRISPR-dCas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以抑制乳酸乳球菌NZ9000基因轉錄，通過此方法成功將乳酸乳球菌NZ9000中假定的青霉素?；D移酶LLNZ-07335鑒定為膽鹽水解酶。Brook E. Heaton等叫使用CRISPR激活技術對限制IAV感染的基因進行了全基因組過表達篩選，并通過鑒定篩選出了B4GALNT2基因，該基因雖然通常不在肺中表達但能夠完全預防IAV感染，該因子可在將來用于預防嚴重的人和禽流感疾病。

（四）基因多重編輯（Multiplex Editing）

將多個sgRNA質(zhì)粒轉入到細胞中，可同時對多個基因進行編輯，具有基因組功能篩選作用。多重編輯的應用包括：使用雙Cas9 nickases提高基因敲除的準確率、大范圍的基因組缺失及同時編輯不同的基因。通常情況下，一個質(zhì)粒上可以構建2～7個不同的sgRNA進行多重CRISPR基因編輯。

（五）功能基因組篩選

利用CRISPR/Cas9進行基因編輯可以產(chǎn)生大量的基因突變細胞，因此，利用這些突變細胞可以確認表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導致的。基因組篩選的傳統(tǒng)方法是shRNA技術，但是shRNA有其局限性：具有很高的脫靶效應以及無法抑制全部基因而形成假陰性的結果。CRISRP/Cas9系統(tǒng)的基因組篩選功能具有高特異性和不可逆性的優(yōu)勢，在基因組篩選中得到了廣泛的應用。目前，CRISPR的基因組篩選功能應用于篩選對表型有調(diào)節(jié)作用的相關基因，如對化療藥物或者毒素產(chǎn)生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構建病毒篩選文庫對潛在基因進行大范圍篩選等。

四、CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的問題及展望

CRISPR /Cas9系統(tǒng)與ZFN和TALEN的基于蛋白質(zhì)的DNA結合的一個關鍵區(qū)別是使用短RNA序列作為特異性決定元件來驅(qū)動靶部位DSB的形成。CRISPR/CAS9的使用避免了蛋白質(zhì)工程開發(fā)針對特定DNA靶序列的位點特異性核酸酶的需要，只需要合成一段新的RNA。這大大簡化并減少了基因編輯設計和實施所需的時間。雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)近年來發(fā)展迅速，已取代之前的基因編輯技術，然而要充分實現(xiàn)CRISPR/Cas9編輯技術的潛力，仍需要應對許多挑戰(zhàn)。

目標位點的選擇和sgRNA設計是一件非常復雜的工作。Cradick等叫在他們的研究中表明，CRISPR/Cas9的特異性可能低于ZFN或TALEN，這是因為其靶向序列相對較短。因此，sgRNA的合理設計仍然需要大量的工作，目前并沒有簡單的算法可以幫助科研人員進行設計。同時，為了提高特異性和減少脫靶率，Cas9系統(tǒng)的設計也并不簡單，同樣需要大量的工作。雖然Cas9本身不會引起脫靶效應，但對Cas9蛋白的改進可以限制這些效應。

關于sgRNA和Cas9蛋白的遞送仍然是CRISPR/Cas9系統(tǒng)使用的障礙之一，目前還沒有出現(xiàn)通用的遞送方法。雖然已經(jīng)出現(xiàn)許多可用于將CRISPR傳遞到單元的多種方法，但每種方法都有利有弊，有些方法可能非常特殊或不適合某些類型的傳遞。

活體生物的安全性也一直是一個令人擔憂的問題，能夠以高特異性靶向所需細胞的遞送工具也將限制非靶標效應并提高安全性。在納米顆粒載體的情況下，對組件的安全性進行長期研究是至關重要的。目前，關于納米顆粒傳遞系統(tǒng)的各種成分最終在體內(nèi)的哪里，它們在那里停留了多長時間，以及是否有任何與任何成分相關的長期毒性的信息和研究仍是有限的。

CRISPR是現(xiàn)代基因工程的新面孔。2020年，詹妮弗.杜德納和埃馬紐埃爾，卡彭蒂耶被授予諾貝爾化學獎，以表彰她們在“憑借開發(fā)基因組編輯方法”方面作出的貢獻，諾貝爾委員會在官方頒獎詞中表示：“借助這些技術，研究人員可以非常精準地改變動物、植物、和微生物的DNA。CRISPR /Cas9基因剪刀徹底改變了分子生命科學，為植物育種帶來了新機遇，有望催生創(chuàng)新性癌癥療法，并可能使治愈遺傳性疾病這一人類夢想美夢成真?！蔽覀円蚕Ｍ鸆RIS-PR/Cas9最終能夠?qū)崿F(xiàn)這個愿望，當然這是一個仍然需要繼續(xù)研究的重要領域。

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基金項目：國家自然科學基金青年項目“miR-140調(diào)控奶牛乳腺脂肪酸代謝的分子機制研究”，項目編號：31802035。

作者簡介：路欽越（1997-），男，內(nèi)蒙古包頭人，碩士，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。

（責任編輯馮會利）