鐘昊然，王培莉，郭 佳，王 亨，朱國(guó)強(qiáng)，李建基，崔璐瑩，董俊升，孟 霞*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

在1/4的革蘭陰性菌中都能發(fā)現(xiàn)六型分泌系統(tǒng)(Type VI secretion system, T6SS)的存在[1-2]。ClpV作為T(mén)6SS的必需組分，能在ATP的驅(qū)動(dòng)下完成T6SS的回收，為T(mén)6SS分泌效應(yīng)因子提供能量[3]。大腸桿菌(Escherichiacoli，Ecoli)被證實(shí)含有3套T6SS，有研究表明T6SS2在侵襲腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且T6SS2也含有核心組分ClpV2[4]。但目前關(guān)于ClpV2的生物學(xué)特性研究卻鮮有報(bào)道[5]。

本研究利用Red同源重組，成功構(gòu)建了TW-XM菌株T6SS2中的clpV2基因突變株，并比較各突變株部分生物學(xué)特性的差異，為深入研究ClpV2在APEC致病性的過(guò)程中發(fā)揮何種作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株APEC TW-XM、DH5α；質(zhì)粒pKD46、pKD3、pCP20均由揚(yáng)州大學(xué)朱國(guó)強(qiáng)教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑、儀器

Marker Ⅲ購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Mueller-Hinton瓊脂購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；常用藥敏片購(gòu)自杭州微生物生物試劑有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)APEC TW-XM菌株已知的clpV2基因序列，設(shè)計(jì)缺失引物ΔclpV2-Cm-F/ΔclpV2-Cm-R、缺失鑒定引物clpV2-F/clpV2-R及回補(bǔ)引物pBR-clpV2-F/pBR-clpV2-R。引物均由南京擎科生物技術(shù)公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 構(gòu)建clpV2基因突變株的引物序列

1.4 clpV2基因突變株的構(gòu)建與遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照丁雪燕等[6]的方法，通過(guò)Red同源重組構(gòu)建clpV2基因缺失株。篩選clpV2線性片段與含有pKD46的TW-XM感受態(tài)細(xì)胞的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，以clpV2-F/clpV2-R為引物進(jìn)行PCR鑒定。隨后將pCP20質(zhì)粒導(dǎo)入一次重組菌中，再次以clpV2-F/clpV2-R為引物進(jìn)行PCR鑒定。鑒定正確后命名為T(mén)W-XM△clpV2。以pBR-clpV2-F/pBR-clpV2-R為引物，TW-XM為模板，擴(kuò)增得到clpV2基因。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后克隆至表達(dá)載體pBR322中，將重組質(zhì)粒pBR322-clpV2轉(zhuǎn)化至TW-XM△clpV2，得到回補(bǔ)株TW-XMC△clpV2。

將上述得到的突變株連續(xù)傳代，取第1、10、20、30代進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析。

1.5 生長(zhǎng)曲線及運(yùn)動(dòng)性測(cè)定

將各菌株菌液按1∶100轉(zhuǎn)接至30 mL新鮮的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃ 180 r·min-1震蕩培養(yǎng)，每小時(shí)取100 μL測(cè)定培養(yǎng)物的OD630 nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。將1 μL培養(yǎng)至OD630 nm=1.0的菌液滴加于半固體平皿中心，37 ℃培養(yǎng)18 h后測(cè)定細(xì)菌運(yùn)動(dòng)環(huán)直徑。

1.6 生物被膜形成能力測(cè)定

采用96孔微孔板法測(cè)定生物被膜形成能力。將濃度為OD630 nm=1.0的各菌株菌液，按1∶100接種至96孔板中培養(yǎng)24 h。在蒸餾水洗滌后加入2%結(jié)晶紫染色20 min，洗滌后加入95%乙醇，檢測(cè)OD630 nm值。

1.7 藥物敏感性試驗(yàn)

用K-B法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)藥物敏感性。將新鮮菌液配成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪汉螅贛-H瓊脂表面均勻涂布，將藥敏片貼于瓊脂表面，37 ℃培養(yǎng)18 h，測(cè)量抑菌圈直徑大小。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0軟件，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 clpV2基因突變株的構(gòu)建與遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

如圖1所示：野生菌clpV2擴(kuò)增片段為2 688 bp，二次重組體為921 bp。回補(bǔ)株顯示有兩個(gè)特異性條帶，921 bp處為缺失株的二次重組條帶，2 688 bp處為回補(bǔ)質(zhì)粒pBR322-clpV2的clpV2片段，表明各突變株構(gòu)建成功。且連續(xù)傳30代后均未發(fā)生突變，表明突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

M.Marker Ⅲ相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.野生株TW-XM；2～5.缺失株TW-XM△clpV2；6～8.回補(bǔ)株TW-XMC△clpV2

2.2 clpV2基因?qū)ιL(zhǎng)曲線及藥物敏感性的影響

生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，各菌株在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期、遲緩期的生長(zhǎng)情況均無(wú)明顯差異，表明clpV2基因不影響TW-XM的生長(zhǎng)；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示各菌株對(duì)上述9種藥物的敏感性無(wú)明顯差異(結(jié)果未展示)。

2.3 clpV2基因?qū)\(yùn)動(dòng)性及生物被膜形成的影響

TW-XM△clpV2的運(yùn)動(dòng)環(huán)顯著小于野生株(P<0.05)，提示clpV2基因的缺失影響了運(yùn)動(dòng)性(圖2)；TW-XM△clpV2的生物被膜形成能力與野生株相比顯著下降，提示clpV2基因的缺失會(huì)影響生物被膜形成能力(圖3)。

*.P<0.05；ns.P>0.05

*.P<0.05

3 討 論

2000年，Datsenko和Wanner[7]利用兩步同源重組法對(duì)大腸桿菌K-12進(jìn)行了基因敲除，該方法簡(jiǎn)單易行，相比傳統(tǒng)方法重組率也更高[8]。如今，該方法在大腸桿菌的基因敲除中被廣泛應(yīng)用。

國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于clpV的報(bào)道，Liu等[9]在敲除遲緩愛(ài)德華菌(Citrobacterfreundii)中的clpV后發(fā)現(xiàn)細(xì)菌鞭毛蛋白的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)Tang等[10]發(fā)現(xiàn)假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)clpV基因的沉默會(huì)下調(diào)鞭毛合成相關(guān)基因的表達(dá)，而本試驗(yàn)利用Red同源重組敲除clpV2基因后細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力減弱，則證明其與大腸桿菌的運(yùn)動(dòng)能力存在關(guān)聯(lián)。除clpV2基因外，對(duì)T6SS2其余核心組分的研究也有了一定進(jìn)展。Ding等[11]先前已成功敲除APEC CE129中T6SS2的另一核心組分hcp2基因，并對(duì)相應(yīng)突變株進(jìn)行了生物學(xué)特性分析。結(jié)果顯示細(xì)菌的生物被膜形成能力顯著降低、對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的黏附能力顯著減弱、Ⅰ型菌毛主要亞單位基因fimA以及fimC的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低。在本研究中，clpV2的缺失也導(dǎo)致生物被膜形成能力減弱，證明T6SS2可能參與調(diào)控Ⅰ型菌毛的合成，從而影響生物被膜形成能力和黏附能力，進(jìn)而影響致病力。但具體哪些黏附素表達(dá)受到影響還有待進(jìn)一步探索。與此同時(shí)，clpV2基因的缺失不影響細(xì)菌的藥物敏感性，說(shuō)明T6SS2可能不參與耐藥性調(diào)控。

而本試驗(yàn)中TW-XMclpV2基因的成功敲除，有助于深入了解 T6SS2的功能，同時(shí)也為研究APEC TW-XM致腦膜炎的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

利用Red同源重組成功構(gòu)建TW-XM的clpV2基因缺失株，并構(gòu)建相應(yīng)的回補(bǔ)株。各突變株均能穩(wěn)定遺傳，發(fā)現(xiàn)clpV2基因的缺失不影響TW-XM菌株的生長(zhǎng)速度以及對(duì)多種抗生素的敏感性，但會(huì)導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)能力和生物被膜形成能力顯著下降。