蔣 卉，馮 宇，李筱英，范學(xué)政，彭小薇，丁家波

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，國家/OIE布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

布魯氏菌病(簡稱“布病”)是一種由布魯氏菌引起的慢性多器官損傷性人畜共患傳染病，WHO 將布魯氏菌病視為“世界范圍內(nèi)流行最廣泛的人畜共患病，但也是最易被人們所忽視的7種重要傳染病之一”[1]。布病主要是通過直接或間接接觸染病動物或動物產(chǎn)品而感染[2]。人患布病后，會引起發(fā)熱、肌肉和關(guān)節(jié)疼痛等，嚴(yán)重者完全喪失勞動能力；家畜感染布病則引起流產(chǎn)和不育，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]，嚴(yán)重威脅人類食品安全和公共衛(wèi)生安全。

準(zhǔn)確診斷是布病防控極為重要的環(huán)節(jié)[4]，我國對二、三類地區(qū)的動物布病防控政策主要采取“檢驗(yàn)-淘汰”策略。在布病防控實(shí)踐中，因檢測方法或試劑選擇問題常常會導(dǎo)致“假陽性”和“假陰性”結(jié)果，并進(jìn)而引起誤殺或傳染源不能及時剔除出群，這一現(xiàn)象嚴(yán)重阻礙了布病的有效防控。血清學(xué)方法是布病實(shí)驗(yàn)室診斷常用方法[5]，主要包括虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)、全乳環(huán)狀反應(yīng)(MRT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、熒光偏振試驗(yàn)(FPA)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(間接ELISA或競爭ELISA)[6]等。RBT、SAT、MRT等傳統(tǒng)凝集類試驗(yàn)，以滅活的菌體作為診斷抗原，其特異性和敏感性低于FPA、ELISA方法，其中SAT已不作為國際貿(mào)易的法定方法[7-8]。對于大量樣品的檢測，OIE推薦的方法包括熒光偏振法(FPA)、競爭ELISA(cELISA)、間接ELISA(iELISA)和微量法補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(mCFT)，以上方法也是我國國家/OIE布病參考實(shí)驗(yàn)室常用檢測方法。目前市售商品化布病抗體檢測試劑盒種類繁多，但是在臨床檢測中，各類試劑盒因檢測靈敏度的差異，導(dǎo)致同一份血清樣品用不同方法檢測，結(jié)果不一，給檢驗(yàn)人員帶來了較大困惑。

本研究對國家/OIE布病參考實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的4種布病高通量診斷方法(FPA、cELISA、iELISA抗體檢測試劑盒和改進(jìn)的mCFT)進(jìn)行靈敏度、敏感性、特異性分析，并分別用4種診斷方法對臨床315份牛血清樣品進(jìn)行了檢測，比較各方法之間的符合率，為布病診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)化提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

布病抗體陽性牛血清70份，經(jīng)RBT、SAT、CFT檢測均為陽性；布病抗體陰性牛血清82份，經(jīng)RBT、SAT、CFT檢測均為陰性；由本實(shí)驗(yàn)室保存。臨床牛血清共計(jì)315份，由本實(shí)驗(yàn)室從非免疫牛場采集、保存。

1.2 主要試劑

牛布病間接ELISA抗體檢測試劑盒，批號20082602；動物布病競爭ELISA抗體檢測試劑盒，批號20061901；布魯氏菌熒光偏振抗體檢測試劑盒，批號20200809；mCFT用補(bǔ)體、溶血素、抗原等均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家/OIE布病參考實(shí)驗(yàn)室提供。布病陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品(牛源)購自英國NIBSC，經(jīng)試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)標(biāo)定為1 000 IU，批號2BADS。mCFT所用紅細(xì)胞按參考文獻(xiàn)[9-10]方法制備。

1.3 布病陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋

用1 mL生理鹽水將布病陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶。再用生理鹽水將血清進(jìn)行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等5個不同稀釋度備用，即血清抗體含量為200、100、50、25、12.5 IU·mL-1。

1.4 4種檢測方法靈敏度的測定

采用FPA、cELISA、iELISA和mCFT分別檢測5個不同稀釋度布病陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品，每個稀釋度重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值，比較各方法之間的檢測靈敏度。FPA、cELISA、iELISA按試劑盒說明書操作。mCFT按照參考文獻(xiàn)[11-12]進(jìn)行，在血清樣品稀釋時使用與常量法CFT相同稀釋度，即1∶10倍稀釋，使mCFT與常量法CFT靈敏度一致。各檢測方法的判定標(biāo)準(zhǔn)：FPA判定標(biāo)準(zhǔn)為△mP值≥20 mP時，為布病抗體陽性(+)；△mP值<20 mP時，為布病抗體陰性(-)。牛布病iELISA判定標(biāo)準(zhǔn)為P%值≥20%時，為牛布病抗體陽性(+)；P%值<20%時，為牛布病抗體陰性(-)。動物布病cELISA判定標(biāo)準(zhǔn)為PI%值≥30%時，為布病抗體陽性(+)；PI%值<30%時，為布病抗體陰性(-)。mCFT判定標(biāo)準(zhǔn)為100%溶血為布病抗體陰性(-)；50%～90%溶血為布病抗體可疑(±)；0～40%溶血為布病抗體陽性(+)。

1.5 對已知陰、陽性血清的特異性和敏感性檢測

采用FPA、cELISA、iELISA和mCFT分別檢測70份已知布病抗體陽性牛血清和82份已知布病抗體陰性牛血清，比較4種不同檢測方法的敏感性和特異性。

1.6 4種檢測方法檢測臨床樣品的符合率比較

將315份血清樣本分別采用FPA、cELISA、iELISA抗體檢測試劑盒和mCFT進(jìn)行檢測，依據(jù)OIE陸生動物手冊和《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T 18646—2018)推薦的確診方法，以mCFT檢測結(jié)果進(jìn)行最終定性檢測，比較4種不同檢測方法之間的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 4種檢測方法靈敏度的測定

將布病陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品(牛源)稀釋成5個不同稀釋度，用FPA、cELISA、iELISA和mCFT進(jìn)行檢測，確定4種檢測方法的靈敏度，結(jié)果見表1。4種檢測方法檢測靈敏度結(jié)果一致，即布病陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品稀釋1∶20(即50 IU·mL-1)均檢測為陽性；布病陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品稀釋1∶40(即25 IU·mL-1)均檢測為陰性。

表1 4種布病抗體檢測方法靈敏度檢測結(jié)果

2.2 對已知陰、陽性血清的特異性和敏感性的檢測

用FPA、cELISA、iELISA和mCFT分別檢測70份已知布病抗體陽性牛血清和82份已知布病抗體陰性牛血清，結(jié)果見表2。FPA、cELISA、iELISA和mCFT方法的敏感性分別為97.14%、100.00%、100.00%、98.57%；特異性分別為96.34%、95.12%、97.56%、100.00%。

表2 對已知陰、陽性血清的特異性和敏感性檢測結(jié)果

2.3 4種檢測方法檢測臨床樣品的符合率

用不同檢測方法對315份臨床牛血清樣品進(jìn)行檢測，各方法之間的符合率見表3～5。表3結(jié)果表明，以mCFT檢測結(jié)果為最終判定標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)PA、cELISA、iELISA與mCFT的結(jié)果符合率分別為96.83%、92.7%、97.14%，其中iELISA與mCFT符合率最高，cELISA與mCFT符合率最低。表4、5結(jié)果表明，F(xiàn)PA、cELISA與iELISA檢測結(jié)果的符合率分別為95.24%和93.65%，F(xiàn)PA與cELISA檢測結(jié)果的符合率為91.43%。

表3 FPA、cELISA、iELISA與mCFT檢測結(jié)果的符合率

表4 FPA、cELISA與iELISA檢測結(jié)果的符合率

表5 FPA與cELISA檢測結(jié)果的符合率

3 討 論

布魯氏菌病是一種重要的人畜共患病，患病動物是人感染布病的主要傳染源[13]，因此做好動物布病的防控對公共衛(wèi)生意義重大。目前布病防控面臨的主要問題之一就是如何實(shí)現(xiàn)科學(xué)準(zhǔn)確的診斷。解決這一難題的關(guān)鍵在于兩個方面，一是檢測方法及診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)化，二是使用敏感性和特異性更高的檢測方法替代傳統(tǒng)凝集類試驗(yàn)[14-15]，如FPA、cELISA、iELISA、mCFT等。現(xiàn)行《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T 18646—2018)國家標(biāo)準(zhǔn)中雖已納入cELISA和iELISA方法，但與OIE手冊存在差異[11]，標(biāo)準(zhǔn)中未對兩種ELISA方法的檢測靈敏度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，因而在臨床診斷中使用不同商品化試劑盒或同一公司不同批次的試劑盒檢測同一批血清樣品時，往往會出現(xiàn)檢測結(jié)果的顯著差異。因檢測結(jié)果不準(zhǔn)確導(dǎo)致陽性動物不能及時隔離出群以及陰性動物被誤殺常常阻礙了布病的凈化工作。

研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)選用的FPA、cELISA、iELISA抗體檢測試劑盒和改進(jìn)的mCFT，其檢測靈敏度被有效控制在同一水平，即布病陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品稀釋1∶20(即50 IU·mL-1)均檢測為陽性；布病陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品稀釋1∶40(即25 IU·mL-1)均檢測為陰性。由于不同方法檢測的臨界值與常量法補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)一致，不僅確保了不同方法之間檢測結(jié)果的彼此吻合性，而且也有效確保了診斷的準(zhǔn)確性。對70份已知布病抗體陽性牛血清和82份已知布病抗體陰性牛血清的檢測結(jié)果顯示，4種檢測方法的敏感性均高于97%，特異性均高于95%。

對臨床315份牛血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果4種方法之間的符合率均高于90%，證實(shí)了統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)的重要性。4種方法中iELISA與mCFT符合率最高，達(dá)97.14%，cELISA與mCFT符合率最低，僅為91.43%。這主要是由于不同方法檢測的抗體類型差異所致，iELISA與mCFT均主要檢測IgG類抗體[16-17]，而cELISA可同時檢測血清中特異性IgM和IgG抗體。由于布病陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品在制備過程中只保留了IgG類特異性抗體，其定值依據(jù)IgG的含量確定，在此基礎(chǔ)上統(tǒng)一的各種診斷方法靈敏度(50 IU·mL-1)對于只檢測IgG類抗體的方法(如iELISA和CFT)是精確的，而對能同時檢測IgM類抗體的cELISA則是相對的。對于一份感染早期的血清，只需要IgM和IgG的總量達(dá)到50 IU·mL-1，在cELISA中就表現(xiàn)為陽性，因此cELISA相對于其他方法，其敏感性更高，可能會檢測出更多的陽性樣品。以上研究結(jié)果與董浩等[18]開展的研究結(jié)果一致，其采用國家/OIE布病參考實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的cELISA、iELISA抗體檢測試劑盒等對300份臨床樣品進(jìn)行檢測，對63份檢測結(jié)果不一致的樣品用CFT復(fù)核，結(jié)果iELISA與CFT的符合率最高，為98.41%[18]。因此，在布病血清學(xué)診斷中因cELISA可檢測更多的抗體類型，具有更好的敏感性，適合于動物布病的初篩；iELISA與CFT均檢測IgG類抗體，適合于動物布病的確診。但前提是各檢測方法應(yīng)具有相同的靈敏度，這就要求試驗(yàn)人員在試驗(yàn)前對不同試劑盒進(jìn)行靈敏度測定，靈敏度過高的試劑盒容易導(dǎo)致高比例的假陽性，造成誤殺。反之就有高比例的假陰性，導(dǎo)致陽性動物不能被及時發(fā)現(xiàn)，造成群體的持續(xù)感染。

除了cELISA和iELISA，F(xiàn)PA也是OIE推薦的國際貿(mào)易指定方法，已被用于北美和歐洲的布病根除計(jì)劃[19-20]，但現(xiàn)行《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T 18646—2018)國家標(biāo)準(zhǔn)中未收錄該方法，目前我國僅部分大型養(yǎng)殖集團(tuán)采用該方法進(jìn)行布病血清學(xué)監(jiān)測。FPA利用了生物物理學(xué)原理對布魯氏菌特異性抗體進(jìn)行檢測，當(dāng)熒光素標(biāo)記的布魯氏菌特異性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，導(dǎo)致其對激發(fā)光的旋光能力發(fā)生變化，根據(jù)旋光偏振的角度大小，判定是否含有特定的抗體。該方法與同樣適用于血清學(xué)監(jiān)測的RBT相比，最大優(yōu)點(diǎn)是檢測效率高，檢測一塊96孔板的時間僅為20 min，但是需要專有設(shè)備，檢測成本較高。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)PA抗體檢測試劑盒同樣具有較高的準(zhǔn)確性，與mCFT、iELISA方法符合率分別為96.83%、95.24%，高于與cELISA的符合率(91.43%)，提示FPA方法對IgM類抗體敏感性低，這可能與IgM抗體的分子對稱性結(jié)構(gòu)有關(guān)。FPA準(zhǔn)確快捷的特點(diǎn)非常適用于大量樣本的血清學(xué)監(jiān)測。

總之，當(dāng)統(tǒng)一了診斷標(biāo)準(zhǔn)后，不同布病血清學(xué)方法之間存在較高的符合率。根據(jù)各方法檢測的抗體類型差異，cELISA適合于動物布病的初篩，F(xiàn)PA適用于常規(guī)血清學(xué)監(jiān)測，mCFT和iELISA適用于布病確診。但實(shí)踐中，由于各試劑盒生產(chǎn)企業(yè)對于診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)化的認(rèn)識不足，往往導(dǎo)致各檢測方法的靈敏度各異，出現(xiàn)cELISA的敏感性低于iELISA的結(jié)果。因此急需盡快啟動《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T 18646—2018)的修訂，對各檢測方法檢測靈敏度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定，提高我國布病診斷試劑的質(zhì)量，為布病防控提供可靠的技術(shù)支撐。

4 結(jié) 論

比較了國家/OIE布病參考實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的FPA、cELISA、iELISA抗體檢測試劑盒和改進(jìn)的mCFT的靈敏度、敏感性、特異性和檢測臨床樣品的符合率。當(dāng)4種方法的檢測靈敏度一致時，不同布病血清學(xué)方法的敏感性、特異性以及對臨床樣品檢測結(jié)果的符合率均高于90%。本研究為科學(xué)選擇和使用布魯氏菌抗體檢測方法，推動布病診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)化提供了參考。