林晨陽，許志亮，曾賓華，羅艷榮

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○九醫(yī)院耳鼻喉頜面外科，福建 漳州 363000)

舌鱗狀細(xì)胞癌是一種惡性腫瘤，常發(fā)病于口腔面部，其病因目前尚不清楚。長時(shí)間吸煙喝酒、日常不注意口腔衛(wèi)生、長期異物飲食是需要注意的致病因素。鱗狀細(xì)胞癌具有生長速度快、轉(zhuǎn)移頻率高、容易浸潤等特征，是導(dǎo)致患者病情加重甚至死亡的重要原因[1-2]。因此，研究有效抗鱗狀細(xì)胞癌生長、轉(zhuǎn)移的藥物具有重要意義。白楊素是從傳統(tǒng)天然藥物蜂膠以及中草藥中提取的具有抗炎、抗氧化、抗惡性腫瘤等藥理學(xué)作用的黃酮類化合物[3-4]。體內(nèi)外研究證實(shí)，白楊素及其衍生物具有抑制癌細(xì)胞活力、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，白楊素具有抑制舌鱗狀細(xì)胞活力以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[7]。因此，本研究從細(xì)胞水平角度進(jìn)行分析，觀察白楊素對舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞活力、形態(tài)及凋亡的影響，以期為舌鱗狀細(xì)胞癌的診治提供分子基礎(chǔ)方面的參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

人口腔舌鱗狀細(xì)胞CAL-27細(xì)胞系購自上海富盛實(shí)業(yè)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自友康恒業(yè)生物科技(北京)有限公司；白楊素、噻唑藍(lán)溴化四唑(MTT)以及活性Caspase-3抗體購于美國Sigma-Aldrich公司；TUNEL試劑盒、免疫染色固定液(P0098)、PBS磷酸鹽緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Bcl-2抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 MTT法檢測細(xì)胞活力

將對數(shù)生長期的CAL-27細(xì)胞接種于96孔板，加入不同濃度的白楊素(1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L)，并設(shè)置不做任何處理的空白對照組及以0.1%DMSO試劑處理的DMSO組，每組設(shè)立5個(gè)復(fù)孔。24 h后，向每孔加入MTT溶液(5 mg/mL，以PBS配制)10 μL繼續(xù)孵育4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)上清液小心吸出并丟棄，將0.1% DMSO試劑加入到每孔中,每孔100 μL，振蕩10～15 min，直到結(jié)晶物充分溶解后，開始測定各孔光密度值(OD值)。細(xì)胞生存率=(白楊素各組OD值均數(shù)-空白對照組OD值均數(shù))/(DMSO組OD值均數(shù)-空白對照組OD值均數(shù))×100%。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察

將舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞系放置于RPMI 1640培養(yǎng)基中，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/mL，置于無菌恒溫(37 ℃)培養(yǎng)箱中進(jìn)行培育。將舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27分為空白對照組和白楊素組?？瞻讓φ战M采用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，不加任何藥物試劑；在MTT實(shí)驗(yàn)中，白楊素的IC50值為10.27 μmol/L，因此，白楊素組細(xì)胞用10.0 μmol/L白楊素連續(xù)處理5 d，記作白楊素組。將空白對照組與白楊素組細(xì)胞放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，然后使用倒置光學(xué)顯微鏡觀察并記錄。

1.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

將實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)所用的CAL-27貼壁細(xì)胞接種于載玻片上，藥物處理分組如下：空白對照組、白楊素組(10.0 μmol/L)，藥物作用時(shí)間為48 h。用PBS洗滌后，使用細(xì)胞固定劑對細(xì)胞進(jìn)行免疫染色30～60 min，用PBS洗滌，然后添加TUNEL檢測液100 μL，對細(xì)胞進(jìn)行1 h避光培育，用PBS洗滌1次，用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Western blot印跡法檢測Bcl-2及活性Caspase-3蛋白的表達(dá)

將對數(shù)生長期的CAL-27細(xì)胞接種到6孔板上，藥物處理分組如下：空白對照組、白楊素組(10.0 μmol/L)，藥物作用時(shí)間為48 h。將多余培養(yǎng)液全部吸走，PBS預(yù)冷洗滌，在低溫環(huán)境下加入裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解，充分裂解后，采集細(xì)胞裂解液進(jìn)行離心，提取上清液，使用BCA蛋白定量方法測定蛋白濃度。取相同數(shù)量的蛋白和10% SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，60 min后，將凝膠浸于轉(zhuǎn)膜緩沖液10 min后移至PVDF膜，加入封閉劑封閉過夜，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，回收一抗，TBST溶液清洗膜3次，每次10 min；然后加入對應(yīng)二抗(1∶2 000)孵育30～60 min,PBS清洗，然后顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度白楊素對CAL-27細(xì)胞活力的影響

MTT試驗(yàn)顯示：CAL-27細(xì)胞經(jīng)不同濃度白楊素(1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L)處理24 h后，其細(xì)胞增殖活性被抑制(P<0.05)；空白對照組與DMSO組的細(xì)胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。白楊素的IC50值為10.27 μmol/L，故采用濃度為10.0 μmol/L的白楊素用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 各組CAL-27細(xì)胞活力比較

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

空白對照組，即正常舌細(xì)胞為梭型，較圓潤，分散貼壁生長。白楊素組細(xì)胞較扁，體積明顯增加，核分裂現(xiàn)象較多，48 h后貼壁不佳，視野范圍內(nèi)可見少數(shù)凋亡小體，極少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)固縮狀態(tài)，懸于培養(yǎng)基中(圖2)。

a:空白對照組;b:白楊素組

2.3 白楊素對CAL-27細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，10.0 μmol/L白楊素顯著促進(jìn)CAL-27細(xì)胞凋亡(P<0.05)，而空白對照組與DMSO組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

a:CAL-27細(xì)胞凋亡情況；b:視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì) *：與空白對照組比較，P<0.05；#：與DMSO組比較，P<0.05

2.4 白楊素對CAL-27細(xì)胞的Bcl-2及Caspase-3表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，白楊素可誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)顯著下降及Caspase-3活性表達(dá)顯著上升，但空白對照組與DMSO組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

a:Western blot檢測Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)；b:Caspase-3相對OD值；c:Bcl-2相對OD值 *：與空白對照組比較，P<0.05；#：與DMSO組比較，P<0.05

3 討論

舌鱗狀細(xì)胞癌常發(fā)生于人面部，除了手術(shù)切除，暫無其他合適的臨床治療手段，且手術(shù)前后仍需要進(jìn)行持續(xù)的化療和放療。目前，臨床使用的化療、放療不良反應(yīng)大，許多患者在化療、放療過程中需承受巨大痛苦，且治療效果不佳。因此，研究不良反應(yīng)輕、易被大眾接受的抗口腔鱗狀細(xì)胞癌藥物具有重要意義。白楊素是一種黃酮類化合物，具有明顯的抗癌作用[8-11]，可通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等途徑實(shí)現(xiàn)抗癌作用，值得深入研究。

在細(xì)胞的凋亡機(jī)制中，處于非常核心地位的Caspase系列蛋白酶可以直接參與凋亡細(xì)胞的離散過程。而在細(xì)胞凋亡過程中，活性Caspase-3蛋白的表達(dá)和細(xì)胞凋亡程度緊密相關(guān)[12-15]。Bcl-2蛋白則是另一類凋亡調(diào)控蛋白，與細(xì)胞凋亡也密切相關(guān)[16-19]。謝雅馨等[20]通過體外培養(yǎng)口腔鱗狀細(xì)胞癌KB細(xì)胞研究白楊素對細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)白楊素能夠顯著抑制KB細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且隨著白楊素濃度的增加，其抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用也會明顯增強(qiáng)，提示白楊素抗口腔鱗狀細(xì)胞癌作用明顯，且其機(jī)制可能與誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡相關(guān)。

本研究選取體外人工培養(yǎng)的舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，設(shè)立空白對照組和DMSO組，白楊素組給予CAL-27細(xì)胞不同濃度的白楊素提取物，采用MTT法檢測細(xì)胞的生存率，發(fā)現(xiàn)CAL-27細(xì)胞經(jīng)不同濃度白楊素(1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L)處理24 h后，其細(xì)胞增殖活性逐漸被抑制，且濃度越高，被抑制的程度越明顯，說明白楊素會導(dǎo)致CAL-27細(xì)胞活力降低，且具有劑量依賴性；采用倒置光學(xué)顯微鏡觀察CAL-27細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，空白對照組與白楊素組細(xì)胞有明顯差異，同時(shí)白楊素組出現(xiàn)凋亡小體；TUNEL檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)與空白對照組以及DMSO組比較，白楊素組凋亡細(xì)胞顯著增多，說明白楊素可以誘導(dǎo)CAL-27細(xì)胞凋亡；Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，白楊素可顯著抑制Bcl-2的表達(dá)，增加Caspase-3活性表達(dá)，因此，可以初步判斷，白楊素通過影響B(tài)cl-2及Caspase-3活性表達(dá)對舌鱗狀細(xì)胞癌的凋亡產(chǎn)生調(diào)控作用。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究初步證明了白楊素可影響舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞的存活和凋亡，但其具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，白楊素可抑制舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞活力，并通過調(diào)控細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Caspase-3表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。